張 燕 陳志飛 趙頌寧 張 婷 劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春 130062）

氧化應(yīng)激（Oxidative stress，OS）為活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡[1-2]。機(jī)體處于OS狀態(tài)時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)大分子產(chǎn)生氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能退化、衰老和凋亡，并對(duì)機(jī)體造成不可逆損害。氧化應(yīng)激和機(jī)體衰老密切相關(guān)，并且參與動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程。無(wú)論從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度還是臨床醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，氧化應(yīng)激對(duì)人體健康的影響已不可忽視，目前相關(guān)的研究已經(jīng)引起科研工作者的廣泛關(guān)注。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們知識(shí)水平和生活水平的不斷提高，人工合成抗氧化劑的安全性受到廣泛質(zhì)疑，由此引發(fā)人們對(duì)天然、安全來(lái)源的抗氧化劑研究的極大關(guān)注[3-4]。生物活性肽（Bioactive peptides）具有比氨基酸和蛋白質(zhì)更強(qiáng)的生物活性和多樣性，更易吸收并且安全可靠，已成為國(guó)內(nèi)外科技工作者的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)[5-7]。禽蛋蛋白質(zhì)含量豐富，且其氨基酸組成與人類必需氨基酸比例接近，是獲取生物活性肽的良好資源。近來(lái)有研究表明，蛋清源肽具有一系列的生物活性，如抗氧化，抗高血壓，抗糖尿病，抑制氧化應(yīng)激和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性等[8-13]。

本文從細(xì)胞及蛋白水平研究了蛋清源抗氧化肽對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用及其機(jī)制，為預(yù)防氧化應(yīng)激可能對(duì)人體造成的傷害提供新的預(yù)防思路，為蛋品在食品深加工、制藥和化妝品等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，并有助于人們深入了解機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的機(jī)制，為增加蛋品附加值，提高蛋品利潤(rùn)空間提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清源肽（＞95%），上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；人胚腎細(xì)胞（HEK293），中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

Trolox（分析純）、二苯代苦味肼基（DPPH，分析純）、ABTS（分析純）、熒光素鈉（Fluorescein sodium，分析純）、AAPH（分析純），美國(guó) Sigma 公司；戊二醛固定液（2.5%）、圓形玻璃蓋玻片，上海釜誠(chéng)生物科技有限公司；細(xì)胞丙二醛（MDA）測(cè)試盒、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒、總蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司；過(guò)氧化氫（分析純），天津化學(xué)有限公司；MTS單細(xì)胞溶液增殖檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司；BCA蛋白定量分析試劑盒，鼎國(guó)生物有限公司；SOD抗體、β-actin抗體、GPx1抗體，英國(guó)Abcam生物公司；過(guò)硫酸鉀、甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，北京化工廠。

8條蛋清源五肽的序列簡(jiǎn)寫(xiě)分別為QGYIF（Gln-Gly-Tyr-Ile-Phe）、WNWAD（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）、FWIHI（Phe-Trp-Ile-His-Ile）、WLKFI（Trp-Leu-Lys-Phe-Ile）、RIFQW（Arg-Ile-Phe-Gln-Trp）、CFDVF（Cys-Phe-Asp-Val-Phe）、EWTSS（Glu-Trp-Thr-Ser-Ser）和VYQFL（Val-Tyr-Gln-Phe-Leu）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底），德國(guó)Greiner Bio-One公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；雪花制冰機(jī)FM130，北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司；基礎(chǔ)電源、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；c300凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Azure公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋清肽DPPH自由基清除活性測(cè)定 DPPH自由基清除活性按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，具體操作如下：用80%甲醇配制濃度為150 μmol/L的DPPH溶液，在96孔板的每孔中加200 μL DPPH溶液，每孔加樣品50 μL。室溫避光反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀（Microplate reader）在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。DPPH溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

試驗(yàn)分為3 組：（1）空白組：200 μL 甲醇溶液加 50 μL 蒸餾水；（2）對(duì)照組：200 μL DPPH 溶液加 50 μL 蒸餾水；（3）試驗(yàn)組：200 μL DPPH 溶液加樣品 50 μL（終濃度 1，10，100，1 000 μmol/L）。每個(gè)樣品濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值。DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

式中，ADPPH——DPPH溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度；As——包含樣品和DPPH溶液的吸光度。

以Trolox溶液作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，設(shè)置系列濃度梯度的Trolox 溶液（10，50，100，200，400 μmol/L）與DPPH溶液反應(yīng)。以Trolox濃度值為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。一定濃度的樣品溶液，測(cè)定其DPPH清除率后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Trolox當(dāng)量，確定其相對(duì)抗氧化活性，結(jié)果表示為Trolox抗氧化當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC Value），此處定義其單位為μmol/L TE/1 000 μmol/L，即樣品濃度為1 000 μmol/L時(shí)自由基清除能力相當(dāng)于多少μmol/L的Trolox自由基清除能力。同一濃度的不同樣品，如果其TEAC值越大，說(shuō)明其清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。

1.3.2 蛋清源活性肽對(duì)ABTS自由基清除活性測(cè)定 ABTS與過(guò)氧化物酶和氫過(guò)氧化物在一起形成ABTS+陽(yáng)離子自由基。在抗氧化劑存在時(shí)，這種自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取決于抗氧化劑的抗氧化能力。ABTS自由基清除活性按照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法進(jìn)行測(cè)定[14]，略有修改。取1片（10 mg）ABTS于蒸餾水中配制成7 mmol/L的ABTS溶液，與過(guò)硫酸鉀溶液（終濃度為2.45 mmol/L）按1∶1的體積比混合即得ABTS儲(chǔ)備液，使用前需在室溫條件下避光12～16 h。測(cè)定前用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）稀釋ABTS儲(chǔ)備液至吸光度為（0.7±0.02）左右，為ABTS工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。試驗(yàn)分為3組，每個(gè)樣品濃度3個(gè)復(fù)孔，空白組：每孔加200 μL PBS溶液；對(duì)照組：每孔 180 μL ABTS 工作液+20 μL PBS；試驗(yàn)組：每孔 180 μL ABTS 工作液+20 μL 肽溶液（終濃度分別為1，5，10，15，20，25，30，35，40 μmol/L）。以Trolox溶液作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，設(shè)置系列濃度梯度的Trolox 溶液（10，20，50，100 μmol/L）與ABTS工作液反應(yīng)，以Trolox濃度值為橫坐標(biāo)，ABTS清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Trolox抗氧化當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC值），即被測(cè)抗氧化劑清除ABTS的能力（吸光度大小的變化）與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑trolox（VE的水溶性類似物）清除ABTS的能力的比值，從而確定各條肽的相對(duì)抗氧化活性。按公式（2）計(jì)算。

式中，A1——試驗(yàn)組的吸光度；A2——對(duì)照組的吸光度；A3——空白組的吸光度。

1.3.3 蛋清肽氧化自由基吸收能力（ORAC）測(cè)定 ORAC試驗(yàn)參考Lin等[14]的方法并略作修改。反應(yīng)在 75 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）溶液中進(jìn)行。吸取20 μL樣品溶液和120 μL熒光素鈉溶液（終濃度為70 nmol/L）至黑色96孔板各孔中混合反應(yīng)，在37℃下預(yù)熱2 min，然后用多道移液器快速加入 60 μL AAPH溶液（終濃度為12 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，并將黑色96孔板立即放入酶標(biāo)儀中，在37℃下檢測(cè)記錄。相鄰兩個(gè)測(cè)定點(diǎn)之間的時(shí)間間隔設(shè)置為2 min，每次讀數(shù)前振板2 s，連續(xù)測(cè)定180 min（熒光衰減趨于穩(wěn)定為止）。設(shè)置酶標(biāo)儀的激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。

試驗(yàn)中8條五肽的終濃度均為10 μmol/L，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M為120 μL熒光素鈉溶液加20 μL PBS溶液。AAPH自由基作用下的熒光衰退曲線下面積按公式（3）計(jì)算。

式中，f0——初始0 min時(shí)的熒光相對(duì)強(qiáng)度；fi——第i個(gè)測(cè)定點(diǎn)時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

樣品的抗氧化能力與AAPH自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積（Net AUC）直接相關(guān)。樣品作用下的熒光衰退曲線下面積與空白組的熒光衰退曲線下面積之差，即熒光熄滅曲線的延遲部分面積Net AUC為樣品的保護(hù)面積，按公式（4）計(jì)算。

Trolox是維生素E的水溶性類似物，是一種常用的抗氧化劑和自由基清除劑。在ORAC法中Trolox溶液可作為陽(yáng)性對(duì)照物和標(biāo)準(zhǔn)溶液。抗氧化劑的氧自由基清除能力ORAC值，又稱為抗氧化劑的抗氧化能力指數(shù)，是通過(guò)熒光衰退曲線的保護(hù)面積與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)Trolox的保護(hù)面積相比得出。ORAC值以Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）來(lái)表示，單位為μmol/L TE/μmol/L，按公式（5）計(jì)算。

1.3.4 蛋清肽對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用 HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)方法參考陳志飛等[8]的方法。完全培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗和非必需氨基酸溶液以90∶10∶1∶1的體積比配制而成。將密度為5.0×104cells/mL的HEK293細(xì)胞接種于96孔板各孔中，每孔接種90 μL，試驗(yàn)設(shè)置空白組（100 μL 培養(yǎng)基）、對(duì)照組（90 μL 細(xì)胞混懸液+10 μL 培養(yǎng)基）和試驗(yàn)組（90 μL 細(xì)胞混懸液），培養(yǎng)24 h。然后在試驗(yàn)組中加入10 μL終濃度為1，10，20 μmol/L的蛋清五肽溶液（每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔），在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，細(xì)胞存活率的檢測(cè)采用單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CellTiter 96RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit），即 MTS 法[8]測(cè)定。

1.3.5 蛋清源活性肽對(duì)H2O2氧化損傷的HEK293細(xì)胞的保護(hù)作用 將密度為6.0×104cells/mL的HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種80 μL。 設(shè)置空白組（100 μL 培養(yǎng)基）、對(duì)照組（80 μL細(xì)胞混懸液+20 μL 培養(yǎng)基）、損傷組（80 μL 細(xì)胞混懸液）和保護(hù)組（80 μL細(xì)胞混懸液），每個(gè)試驗(yàn)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。損傷組細(xì)胞的處理采用已建立的過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的建立方法[8]。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，保護(hù)組加入 10 μL 終濃度 1，10，20 μmol/L的蛋清五肽溶液，同時(shí)損傷組加入10 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。然后，損傷組和保護(hù)組同時(shí)加入10 μL 終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，MTS法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.6 HEK293 細(xì)胞 LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX檢測(cè) 試驗(yàn)分組參照1.3.5節(jié)的方法，用6孔板來(lái)接種培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，細(xì)胞密度為5.0×105cells/mL，每孔接種量為2 mL（每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），其中保護(hù)組加入250 μL終濃度為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μmol/L的蛋清源 五肽WNWAD溶液，最后損傷組和保護(hù)組同時(shí)加入250 μL 終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液。 分組處理完細(xì)胞后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液備用（LDH試驗(yàn)需要）；各孔加入500 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，然后在4℃下12 000 r/min離心10 min，吸取各組細(xì)胞懸液在4℃冷藏備用（6 h內(nèi)測(cè)定完各項(xiàng)酶系指標(biāo)）。最后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 HEK293細(xì)胞線粒體凋亡通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western-blot試驗(yàn)參考SaghirAkhtar等[15]和He等[16]的方法并略作修改。將HEK293細(xì)胞以密度為7.0×105cells/皿接種到10 cm培養(yǎng)皿中，每皿接種量為8 mL，試驗(yàn)分組情況參照1.3.5節(jié)的方法，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。其中保護(hù)組加入1 000 μL終濃度為1 μmol/L和10 μmol/L的蛋清源五肽WNWAD溶液孵育24 h，最后損傷組和保護(hù)組同時(shí)加入1 000 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液繼續(xù)孵育6 h。

然后按說(shuō)明書(shū)提取并測(cè)定蛋白含量，取蛋白樣品與4×SDS凝膠上樣緩沖液混合后煮沸變性，SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS溶解封閉。再分別與一抗βactin（1∶10 000）、SOD（1∶1 000）、CAT（1 ∶1 000）、Gpx-1（1∶1 000）4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST 溶液洗 3 次。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST溶液洗3次。二抗孵育結(jié)束后，采用凝膠成像系統(tǒng)直接掃描成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）來(lái)表示。使用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS19.0版處理。差異顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）來(lái)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清源五肽DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是評(píng)價(jià)某種物質(zhì)體外抗氧化活性的常用的化學(xué)方法，此方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)。DPPH自由基溶液為深紫色，在520 nm波長(zhǎng)處具有最大的吸光度值，當(dāng)單電子的二苯代苦味肼自由基（DPPH）與抗氧化劑提供的電子或氫原子結(jié)合配對(duì)時(shí)，會(huì)使DPPH自由基溶液的特征紫色消失，因此可根據(jù)溶液顏色的變化程度來(lái)評(píng)價(jià)某種物質(zhì)的抗氧化能力。

Trolox清除DPPH自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。以DPPH自由基清除率對(duì)Trolox濃度線性擬合得到方程y=0.232x+1.59，R2=0.9935，兩者呈良好的線性關(guān)系。

不同序列的蛋清源五肽的自由基清除率如圖2所示。其中，DPPH自由基清除活性最強(qiáng)的為五肽 CFDVF，在濃度為1，10，100，1 000 μmol/L 時(shí)，其自由基清除率分別為2.74%±1.8%%，6.88%±3.9%，11.44%±1.6%，50.14%±2.1%。其它 7種五肽DPPH自由基清除能力相對(duì)五肽CFDVF較差。值得注意的是，五肽WNWAD和RIFQW在濃度為1 000 μmol/L時(shí)，也具有較高的自由基清除水平，清除率分別為22.88%±1.9%和21.11%±2.5%，五肽 QGYIF，F(xiàn)WIHI，WLKFI，EWTSS，VYQFL的自由基清除率均較差，在1 000 μmol/L時(shí)的自由基清除率均低于五肽RIFQW。8種蛋清源五肽對(duì)自由基的清除能力均呈濃度依賴性，即隨著肽濃度的增大，其DPPH自由基清除活性也隨之增強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)上看，CFDVF的強(qiáng)抗氧化活性可能與肽鏈N端的半胱氨酸（Cys）殘基有關(guān)，半胱氨酸為含硫氨基酸，側(cè)鏈中的巰基（-SH）為高反應(yīng)性基團(tuán)，顯弱酸性（pK=8.4），易失去質(zhì)子，因此半胱氨酸易與二苯代苦味肼自由基（DPPH）中的電子偶合。WN-WAD和RIFQW也具有較強(qiáng)的自由基清除能力，這可能與其N端和C端均為色氨酸（Trp）殘基有關(guān)，色氨酸為芳香族氨基酸，可通過(guò)供氫和DPPH

圖1 DPPH自由基清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of DPPH radical scavenging activity

8種蛋清源五肽的抗氧化活性可以通過(guò)Trolox抗氧化當(dāng)量來(lái)表示。其中，濃度為1 000 μmol/L時(shí)的Trolox抗氧化當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC Value）如表1所示，這與通過(guò)DPPH自由基清除百分率來(lái)表示的趨勢(shì)一致，其中CFDVF的TEAC值最大，為（209.29±0.49）μmol/L TE/1 000 μmol/L，其次為WNWAD和RIFQW，分別為（91.78±0.29），（84.12± 0.41）μmol/L TE/1 000 μmol/L。

表1 蛋清源五肽的Trolox抗氧化當(dāng)量Table1 TEAC Value of pentapeptides from egg white

2.2 蛋清源五肽ABTS+·自由基清除能力

圖2 蛋清源活性五肽DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of pentapeptides from egg white

ABTS+·自由基清除能力是一種常用的評(píng)價(jià)生物樣品抗氧化能力的方法。在反應(yīng)體系中，ABTS會(huì)被氧化生成ABTS+·自由基，它是一種穩(wěn)自由基反應(yīng)，并且其側(cè)鏈帶有一個(gè)雙環(huán)的吲哚基，可通過(guò)共振維持穩(wěn)定。定并可以溶于水的自由基，呈藍(lán)綠色，在734 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度值。ABTS+·自由基與抗氧化劑反應(yīng)可以使前者的特征色褪去，進(jìn)而使吸光度值降低。在同一條件下，生物樣品的抗氧化活性強(qiáng)弱和反應(yīng)溶液吸光度值下降程度成正比。

Trolox清除ABTS+·自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。以ABTS+·自由基清除率對(duì)ABTS+·濃度線性擬合得到方程 y=1.0002x+1.7805，R2=0.9946，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

不同序列蛋清源五肽的自由基清除率如圖4所示，各條五肽在給出的濃度范圍里均呈現(xiàn)出一定的ABTS+·自由基清除能力，Trolox抗氧化當(dāng)量均呈現(xiàn)出量效關(guān)系。在濃度為100 μmol/L時(shí)，VYQFL清除ABTS+·自由基能力最強(qiáng)，TEAC值為（94.66±0.37）μmol/L TE，其次為QGYIF，WLKFI，WNWAD，其活性值分別為（92.8±0.36），（88.34±0.59），（86.06±0.43）μmol/L TE。Aliaga等[17]報(bào)道了ABTS+·自由基與幾種氨基酸的反應(yīng)機(jī)理與動(dòng)力學(xué)。研究表明，反應(yīng)機(jī)理十分復(fù)雜，反應(yīng)速率主要由氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)欠裼胁环€(wěn)定的氫原子決定，并且與溶液的pH值和樣品濃度有關(guān)。在同一反應(yīng)條件下，得到幾種氨基酸清除自由基的活性大小排序?yàn)椋篊ys＞Trp＞Tyr＞His。 與上述研究結(jié)論一致，ABTS+·自由基清除能力較強(qiáng)的蛋清源五肽中，都含有Cys，Trp，Tyr等易在反應(yīng)中失去氫原子的氨基酸。由此可見(jiàn)，蛋清源五肽的ABTS+·自由基清除活性和其氨基酸殘基的種類有關(guān)，不同種類氨基酸殘基和自由基反應(yīng)的活性不同。

圖3 ABTS+·自由基清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of ABTS+·radical scavenging activity

圖4 蛋清源活性五肽清除ABTS+·自由基能力（TEAC值）Fig.4 Trolox equivalent antioxidant capacity of pentapeptides from egg white

2.3 蛋清源五肽氧自由基吸收能力（ORAC活性）

氧自由基吸收能力（ORAC法）是普遍被接受的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法，可以直接反映抗氧化劑阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的能力，是最接近人體生理系統(tǒng)真實(shí)反應(yīng)情況的試驗(yàn)方法，也是用來(lái)對(duì)食品強(qiáng)化劑和其它植物性治療藥物進(jìn)行質(zhì)量控制和檢測(cè)其抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。ORAC反應(yīng)是典型的基于氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制（HAT）的氧化過(guò)程，氫原子轉(zhuǎn)移是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的關(guān)鍵步驟，反應(yīng)后會(huì)形成更加穩(wěn)定的自由基。

圖5表示的是蛋清源五肽在濃度為10 μmol/L時(shí)的熒光衰退曲線。由圖5可知，在對(duì)照組（PBS代替抗氧化劑）中，熒光衰減最快，反應(yīng)開(kāi)始50 min后，熒光衰減曲線開(kāi)始趨于穩(wěn)定，相對(duì)熒光強(qiáng)度接近于0，試驗(yàn)組熒光衰減較對(duì)照組均放緩，說(shuō)明蛋清源五肽都有一定的抗氧化活性。其中，五肽WNWAD的抗氧化能力最強(qiáng)，直至140 min后，相對(duì)熒光強(qiáng)度才接近0。

蛋清源五肽的ORAC值如表5所示：五肽WNWAD的ORAC活性最強(qiáng)，為（2.53±0.18）μmol/L TE/μmol/L，是排在第二位的RIFQW（1.44± 0.05 μmol/L TE/μmol/L）的1.76 倍。 WLKFI和EWTSS也有一定氧自由基吸收活性，TEAC值分別為（1.39±0.13）μmol/L TE/μmol/L和（1.31±0.11）μmol/L TE/μmol/L。 ORAC 試驗(yàn)中偶氮類自由基（AAPH）熱分解后可轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)。分析上述4條五肽的共同之處，可以發(fā)現(xiàn)肽鏈中均含有色氨酸（Trp）殘基，色氨酸是芳香族氨基酸，由于其特殊結(jié)構(gòu)在反應(yīng)中易失去氫原子而與自由基發(fā)生反應(yīng)。因此，當(dāng)色氨酸存在于五肽中時(shí)，五肽也會(huì)表現(xiàn)出一定的供氫能力。WNWAD與RIFQW相比活性要強(qiáng)很多，可能與色氨酸相鄰的氨基酸殘基有關(guān)，在WNWAD中，Trp在 N端，與天冬酰胺（Asn）殘基相接，Trp中的吲哚基雙環(huán)中含有碳碳雙鍵，可與兩者間的酰胺鍵以及Asn中的酰胺產(chǎn)生吸電子的共軛效應(yīng)，導(dǎo)致Trp中五元環(huán)上氮的電子云密度降低，使氫質(zhì)子更易釋放。RIFQW中Trp在C端，與之相鄰的是谷氨酰胺（Gln），Gln和Asn結(jié)構(gòu)相似，只是在R基團(tuán)中比Asn多了一個(gè)亞甲基（-CH2-），減弱了整體的共軛效應(yīng)，故相比WNWAD，RIFQW的失氫質(zhì)子能力較弱，從而ORAC活性較低。

2.4 蛋清源五肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HEK293細(xì)胞存活率的影響

近年來(lái)，對(duì)蛋清蛋白中分離提取的肽的抗氧化活性研究越來(lái)越多[18]，然而其中大多數(shù)研究都集中在體外化學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)上，如ABTS和DPPH自由基清除率等，只有少數(shù)研究利用細(xì)胞氧化損傷模型來(lái)評(píng)價(jià)蛋清源肽對(duì)氧化應(yīng)激抑制的生理活性。Kaustay等[10，19]利用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中分離鑒定的三肽IRW和IQW可以有效降低TNF-α介導(dǎo)的超氧陰離子產(chǎn)生。Ding等[20]研究發(fā)現(xiàn)，從卵清蛋白中提取的ACE抑制肽同時(shí)可以對(duì)H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的Caco-2細(xì)胞模型產(chǎn)生保護(hù)作用。由于氧化應(yīng)激是體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)過(guò)程，應(yīng)用細(xì)胞模型比化學(xué)實(shí)驗(yàn)更能反應(yīng)活性肽氧化應(yīng)激抑制的生理活性和機(jī)制，結(jié)果更具可靠性。

圖5 蛋清源活性五肽清除自由基活性（ORAC法）Fig.5 Peroxyl radical scavenging activity of pentapeptides from egg white

本試驗(yàn)中，采用H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的HEK293細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)蛋清肽的氧化應(yīng)激抑制活性。預(yù)先使用不同濃度的蛋清肽（1，10，20 μmol/L）孵育細(xì)胞24 h，之后再用終濃度為400 μmol/L的H2O2刺激細(xì)胞24 h。如圖6所示，未加蛋清肽的損傷組細(xì)胞存活率僅為對(duì)照組的48.5%±2.3%，有顯著性差異（P<0.01）；使用不同序列蛋清源五肽處理的細(xì)胞，相較于損傷組，細(xì)胞存活率均有一定的提高，說(shuō)明蛋清肽對(duì)H2O2氧化誘導(dǎo)損傷的HEK293細(xì)胞均有一定保護(hù)作用，表現(xiàn)出氧化應(yīng)激抑制活性。其中，五肽EWTSS的氧化應(yīng)激抑制活性最差，在濃度為1，10，20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的49.8%±3.1%，52.6%±1.8%和53.6%±3.0%；五肽WNWAD的氧化應(yīng)激抑制活性最強(qiáng)，在濃度為1 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為對(duì)照組的98.5%±3.0%，相比損傷組，有顯著性差異（P<0.01），隨著WNWAD濃度增大，在濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的89.9%±2.3%和82.6%±3.2%，氧化應(yīng)激抑制活性反而有減小的趨勢(shì)，這可能與高濃度的肽抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用有關(guān)，劉志蘇等[21]研究發(fā)現(xiàn)奧曲肽可以抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖；李曉艷等[22]報(bào)道了降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用，關(guān)于蛋清肽本身對(duì)HEK293細(xì)胞增殖的影響將在接下來(lái)的試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 蛋清源五肽的氧自由基吸收能力（TEAC值）Table2 Oxygen radical absorption activity of pentapeptides from egg white

2.5 蛋清肽對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用

如圖7所示，蛋清肽對(duì)HEK293細(xì)胞既無(wú)促進(jìn)生長(zhǎng)作用，也無(wú)毒性或抑制生長(zhǎng)作用，證明蛋清肽本身對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾作用。為了排除試驗(yàn)中的非特異性干擾，在不添加H2O2的情況下，本部分通過(guò)MTS法檢測(cè)了蛋清肽本身對(duì)HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，蛋清肽本身對(duì)HEK293細(xì)胞無(wú)毒副作用，同時(shí)證明，蛋清肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HEK293模型細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的，而非刺激HEK293細(xì)胞增殖。關(guān)于2.4節(jié)中隨著WNWAD濃度增大，氧化應(yīng)激抑制活性反而有減小的趨勢(shì)的問(wèn)題，可以排除與高濃度肽抑制HEK293細(xì)胞增殖作用有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究。

2.6 蛋清肽對(duì)HEK293細(xì)胞中 LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX活性的影響

乳酸脫氫酶（LDH）是一種存在于所有細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下可生成乳酸，而丙酮酸和2，4-二硝基苯肼在37℃的堿性環(huán)境中可生成紅棕色的丙酮酸二硝基苯腙。因此，利用顯色反應(yīng)即可間接檢測(cè)細(xì)胞中乳酸脫氫酶活性。一般情況下，LDH穩(wěn)定存在于胞質(zhì)內(nèi)，如果細(xì)胞膜受損，LDH可釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)的LDH活性，計(jì)算LDH釋放率可推斷細(xì)胞受損程度。由表3可知，H2O2對(duì)細(xì)胞的損害作用非常明顯，LDH釋放率為23.07%±0.25%，相比對(duì)照組顯著升高（P<0.01），而經(jīng)不同濃度五肽WNWAD處理之后，WNWAD使細(xì)胞LDH釋放率從21.12%±0.41%（P<0.05）下降到 9.45±0.23%（P<0.01），LDH 釋放率顯著下降。這說(shuō)明WNWAD預(yù)處理可以提高細(xì)胞存活率，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。

圖6 蛋清源五肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HEK293細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.6 Protective effect of pentapeptides from egg white on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

圖7 蛋清源五肽對(duì)正常HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effect of pentapeptides from egg white on normal HEK293 cells

丙二醛（MDA）為過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物中的產(chǎn)物，MDA可攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸引起細(xì)胞損傷。MDA可與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，因此可根據(jù)比爾定律，通過(guò)檢測(cè)溶液吸光度值來(lái)間接推斷MDA含量，從而反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞受損程度。如表3所示，損傷組中MDA含量與對(duì)照組相比顯著升高（P<0.01），說(shuō)明過(guò)氧化氫可攻擊生物膜并引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成了大量MDA，保護(hù)組中通過(guò)加入WNWAD預(yù)處理，MDA含量隨著肽濃度的增加逐漸減少，并呈濃度依賴型關(guān)系，在肽濃度為1.0 μmol/L時(shí)，保護(hù)組MDA含量與損傷組相比顯著降低（P<0.01）。細(xì)胞MDA含量的變化，說(shuō)明WNWAD在一定程度上抑制了細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)。

表3 WNWAD對(duì)HEK293 細(xì)胞 LDH、MDA、CAT、T-SOD、GSH-PX的影響（mean±SD）Table3 The effect of WNWAD on LDH，MDA，CAT，T-SOD and GSH-PX in H2O2-induced HEK293 cells（mean±SD）

過(guò)氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（TSOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）均為細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中酶類物質(zhì)的重要組成部分，對(duì)機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡起著非常重要的影響。過(guò)氧化氫酶（CAT）可將H2O2分解為水和氧氣；總超氧化物歧化酶（T-SOD）可清除超氧陰離子自由基，防止細(xì)胞受損；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）可促進(jìn)過(guò)氧化氫和GSH反應(yīng)生成水和GSSG。已有研究表明，H2O2不僅可攻擊生物膜并引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞生物膜完整性，而且可以降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活性[23-25]。

如表3所示，經(jīng)過(guò)H2O2處理后，過(guò)氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的活性和對(duì)照組相比，均顯著下降（P<0.01）。經(jīng)過(guò)WNWAD預(yù)處理的保護(hù)組，隨著肽濃度的升高，3種酶的活性均有所提高，呈濃度依賴型關(guān)系，尤其在肽的濃度為1.0 μmol/L時(shí)，過(guò)氧化氫酶（CAT）活力為（20.63 ± 0.51）U/mg蛋白、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力為（179.39±5.73）U/mg蛋白，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）為33.97±5.02個(gè)活力單位，較對(duì)應(yīng)損傷組的酶活性均有顯著性提高（P<0.01）。

2.7 蛋清肽對(duì)HEK293細(xì)胞中抗氧化酶CAT、SOD和GPX-1表達(dá)的影響

有研究表明，H2O2可以提高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，長(zhǎng)期處于含有自由基的環(huán)境中，可能導(dǎo)致機(jī)體重要的生物大分子遭到破壞，引發(fā)DNA突變，造成機(jī)體器官組織等的損傷并引發(fā)疾病。大量研究表明，氧化應(yīng)激與多種慢性病和急性病有著密切聯(lián)系，常見(jiàn)的有心血管疾病、癌癥、神經(jīng)紊亂、糖尿病、缺血再灌注和衰老[26-30]。因此自由基的清除尤為重要。在細(xì)胞內(nèi)，一個(gè)控制過(guò)量的ROS形成的方法是抗氧化降解酶。在人體抗氧化系統(tǒng)中，SOD1和GPx1作為主要的抗氧化酶分別對(duì)超氧化物和過(guò)氧化氫自由基進(jìn)行清除[31]。在本研究中，報(bào)道了蛋清源抗氧化肽WNWAD對(duì)HEK293細(xì)胞中SOD1、GPx1和CAT抗氧化酶活性及表達(dá)的影響。

本研究已證明蛋清源活性肽的體外清除DPPH、ABTS和ORAC化學(xué)自由基的能力，并且蛋清肽對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)損傷的HEK293細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中抗氧化酶的活性及MDA和LDH的含量。為進(jìn)一步證明WNWAD是否通過(guò)激活體內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)來(lái)對(duì)HEK293細(xì)胞起到保護(hù)作用，本部分通過(guò)Western-blot試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)WNWAD對(duì)抗氧化酶蛋白的表達(dá)情況。如圖8所示，與對(duì)照組相比，損傷組經(jīng)過(guò)400 μmol/L的H2O2處理，可下調(diào)抗氧化酶蛋白SOD1、GPx1和CAT的水平，這表明H2O2降低了抗氧化酶活性并誘導(dǎo)了HEK293細(xì)胞凋亡。同時(shí)在保護(hù)組中，經(jīng)過(guò)不同濃度 WNWAD（1，10 μmol/L）的預(yù)處理后，可以在一定程度上恢復(fù)抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT蛋白的表達(dá)量，這些結(jié)果表明，WNWAD可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT的活性及蛋白表達(dá)水平起到氧化應(yīng)激抑制活性作用。

圖8 WNWAD對(duì)SOD，Gpx-1和CAT表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of WNWAD on level of SOD，Gpx-1 and CAT protein

3 結(jié)論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡而導(dǎo)致產(chǎn)生了大量的中間氧化產(chǎn)物，即產(chǎn)生了過(guò)多的自由基。在對(duì)不同序列氨基酸組成的蛋清源活性肽（QGYIF，WNWAD，F(xiàn)WIHI，WLKFI，RIFQW，CFDVF，EWTSS和VYQFL）的體外化學(xué)清除自由基試驗(yàn)中均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，細(xì)胞試驗(yàn)中WNWAD對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的保護(hù)作用。H2O2可導(dǎo)致細(xì)胞LDH釋放率上升，MDA含量增高，而WNWAD可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，維持細(xì)胞膜完整性，提高細(xì)胞內(nèi)LDH活性，降低MDA含量；并且提高抗氧化酶CAT、T-SOD和GSH-PX的活性。蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)表明，WNWAD預(yù)處理可在一定程度上恢復(fù)H2O2誘導(dǎo)損傷的HEK293細(xì)胞中抗氧化酶CAT、SOD和GSH-PX的蛋白表達(dá)水平。以上研究結(jié)果顯示，WNWAD可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT的活性及蛋白表達(dá)水平起到氧化應(yīng)激抑制作用。