張遠達，陳志強，尚靜雪，蔡小利，戰(zhàn) 文，張鵬舉，付麗云，李海華

(內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，內(nèi)蒙古赤峰市，024070)

烏梅顆粒由烏梅、柿餅、黃連、姜黃、訶子組成。原方烏梅散收載于《中國獸藥典》二部[1]，臨床應(yīng)用于治療幼畜奶瀉。但由于散劑服用劑量大，服用不便，且藥材中的有效成分不易溶出，吸收差[2]。故對烏梅散進行工藝研究將其制成顆粒劑。為控制烏梅顆粒的質(zhì)量，本文對其進行質(zhì)量研究，復(fù)方中烏梅為制劑的君藥，含有大量的有機酸，現(xiàn)代藥理研究表明，烏梅的抗菌和固澀作用與有機酸密切相關(guān)[4]，因此將有機酸中含量最高的檸檬酸作為復(fù)方的有效成分之一。研究建立了高效液相色譜法測定烏梅顆粒復(fù)方中檸檬酸的含量，并在保留原方中黃連的鑒別方法基礎(chǔ)上又增加了烏梅的薄層色譜法進行定性鑒別。實驗證明，該方法簡便、準(zhǔn)確，為烏梅顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-2010CHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；集熱式磁力加熱攪拌器(型號為DF-101S)，金壇市瑞華儀器有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號為RE52-99)、循環(huán)水式真空泵(型號為SHZ-Ⅲ)，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；電子天平(BT25S)；青島海洋化工廠硅膠G薄層板。

烏梅顆粒：批號：180601-180607，來源：內(nèi)蒙古華天制藥有限公司研制。烏梅對照藥材：規(guī)格：5 g；批號:121208-201506；供TLC含量測定比色檢查用，使用前不需要干燥處理；來源：中國食品藥品檢定研究院。黃連對照藥材：規(guī)格：1 g；批號: Z0010704；供TLC含量測定比色檢查用，使用前不需要干燥處理；來源：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。鹽酸小檗堿對照品：規(guī)格：30 mg；批號: 110713-201613；含量：86.8%；來源：中國食品藥品檢定研究院。枸櫞酸對照品：規(guī)格：200 mg；批號: 100396-201603；含量：100.0%；來源：中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 陰性對照溶液制備 根據(jù)處方去除各味藥，按制劑工藝制成相應(yīng)陰性對照，并按各自供試品溶液制備方法制成相應(yīng)溶液，即得[3]。

2.1.2 烏梅薄層色譜鑒別 取烏梅顆粒樣品粉末20 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，加乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL(浸泡約2 min)，傾去石油醚，殘渣加無水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取烏梅對照藥材5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液10 μL和對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，特征性強，陰性無干擾。

1、6烏梅對照藥材 2、3、4供試品溶液 5陰性對照溶液1、6 wumei control herbs 2、3、4 test solution 5 negative control solution圖1 烏梅TLC色譜圖Fig. 1 TLC chromatogram of Wumei

2.1.3 黃連薄層色譜鑒別 取烏梅顆粒樣品0.5 g，加甲醇10 mL，超聲15 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取黃連對照藥材50 mg，加甲醇5 mL，超聲15 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的黃色熒光斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個黃色熒光斑點。結(jié)果見圖2。由圖可知，供試品色譜在與各對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，特征性強，陰性無干擾。

1鹽酸小檗堿對照品 2黃連對照藥材3陰性對照溶液4、5 供試品溶液1 berberine hydrochloride control 2 rhizoma coptidis control3 negative control solution 4, 5 test solution圖2 黃連TLC色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of rhizoma coptidis

2.2 HPLC定量測定

2.2.1 色譜條件 Silgreen C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5%磷酸二氫銨溶液(3∶97)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)；檢測波長為210 nm；流速為0.6 mL/min；柱溫為30℃。含量測定結(jié)果采用外標(biāo)法計算。

2.2.2 對照品溶液的制備 取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品約1 g，精密稱定，精密加入水50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的質(zhì)量，過濾，取上清液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 專屬性考察 如圖3所示，陰性對照在對照品相同保留時間處未出現(xiàn)對應(yīng)色譜峰，表明陰性無干擾。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取枸櫞酸對照品溶液10 mL，置于50 mL量瓶中混勻，用水定容至刻度，再將其倍半稀釋為6個質(zhì)量濃度，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行線性回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 對照色譜圖Fig 3 Controast chromatogram

表1 枸櫞酸線性關(guān)系Tab 1 linear relationship of citric acid

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號180601)，于0、2、4、8、10、12 、24 h在 “2.2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，測得枸櫞酸面積RSD分別為0.40%、0.57%、0.82%、0.91%、2.35%、2.91%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液(批號180601)10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得枸櫞酸面積RSD分別為0.31%、0.96%、0.22%、0.12%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.5 重復(fù)性試驗 取樣品(批號180601)6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，測得枸櫞酸含量RSD分別為0.40%、0.89%、0.33%、1.09%、1.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗 取已知枸櫞酸含量的烏梅顆粒供試品溶液6份，分別精密加入對照品溶液，搖勻，按照上述色譜條件，10 μL進樣測定峰面積，計算得平均回收率為99.21%，RSD為1.52%。見表2。

表2 回收率實驗結(jié)果Tab 2 Experimental results of recovery rate

2.3 樣品含量測定 取6批樣品，按上述“2.2.3”項下方法測定含量，結(jié)果分別為0.18%、0.16%、0.14%、0.14%、0.12%、0.15%，可知6批樣品枸櫞酸平均含量為0.15%。

3 討論與結(jié)論

幼畜奶瀉的中獸醫(yī)治療原則主要以清熱解毒，澀腸止瀉為主[9]，原方“烏梅散”來自于經(jīng)典名方，烏梅顆粒即改變?yōu)趺飞⒌闹苽涔に嚕蛊湓趹?yīng)用、儲存、交通中達到更好的效果。烏梅顆粒中烏梅、黃連等中藥均有止瀉、清熱解毒的作用，在制備工藝中將烏梅顆粒進行提取、濃縮、制粒，使其質(zhì)量可控。

烏梅顆粒原標(biāo)準(zhǔn)以黃連的薄層色譜定性鑒別作為其質(zhì)量控制依據(jù)，為進一步完成檢測的精密度準(zhǔn)確性故本實驗增加了TLC、HPLC 法檢測完善了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在TLC定性鑒別中，本實驗不僅保留原標(biāo)準(zhǔn)黃連的鑒別，還增加了烏梅鑒別及含量測定的方法：薄層色譜定性鑒別測定中，黃連參照原標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果符合規(guī)定。新增的烏梅鑒別參照《獸藥典》的檢測方法，但因本方為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，經(jīng)研究將結(jié)果擬定為噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與烏梅對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。根據(jù)陳琳[10]等人實驗結(jié)果，本研究將枸櫞酸作為復(fù)方制劑質(zhì)量控制指標(biāo)，并參照《中國獸藥典》中烏梅含量測定項下的檢測方法，但因本方是由5味中藥組成的復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，測定時干擾嚴重，故本研究將檢測流速設(shè)定為0.6 mL/min，并通過方法學(xué)研究對其專屬性、線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和加樣回收率進行考察，最終測定的6批樣品其平均值為0.15%，最小值為0.12%。

研究建立了烏梅顆粒復(fù)方制劑中烏梅與黃連的薄層鑒別方法和枸櫞酸含量測定方法，說明烏梅顆粒的質(zhì)量可控，且方法簡便準(zhǔn)確、專屬性強、準(zhǔn)確度高，可用于烏梅顆粒的質(zhì)量控制，為其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。