習(xí) 碩，趙 蕾，史愛華，章振華，李 林，沈 佳，崔麗娜，姜北宇，張建偉

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

禽流感 (Avian influenza, AI) 是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的禽流行性感冒。自1878年首先在意大利發(fā)現(xiàn)以來，全世界范圍內(nèi)都有禽流感毒株引起的流感的流行，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還給人類的公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重威脅[1]。接種由流行毒株制備的疫苗，是預(yù)防禽流感最有效的手段。目前，國內(nèi)的禽流感病毒疫苗抗原主要采用雞胚增殖的方法制備，然而使用雞胚制苗存在以下缺點(diǎn)：首先，病毒在雞胚中的連續(xù)傳代易造成HA基因發(fā)生變異[2-3]，從而導(dǎo)致病毒的免疫原性和病毒毒力的變化；其次，收獲的尿囊液中存在的雞胚雜質(zhì)可造成被免疫雞的過敏反應(yīng)；第三，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)雞胚來源不同，致使抗原批間一致性差；最后，收獲毒液后殘留的帶毒雞胚，處理不當(dāng)也會(huì)造成潛在生物安全危害，為此急需尋求一種新的模式制備禽流感疫苗抗原[4]。

利用傳代細(xì)胞制備疫苗抗原為解決以上問題提供了思路，該方法制備的抗原具有穩(wěn)定、重復(fù)性高、變態(tài)反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，在流感疫苗抗原制備領(lǐng)域，很多學(xué)者對MDCK細(xì)胞制備禽流感疫苗抗原進(jìn)行了研究，MDCK細(xì)胞是由Madin 和 Darby采用健康雄性英國小獵犬(cocker spaniel)的腎臟建立的細(xì)胞系[5]，由于該細(xì)胞系對各種禽流感病毒均較敏感，已廣泛應(yīng)用于禽流感病毒的檢測及培養(yǎng)領(lǐng)域，同時(shí)認(rèn)為MDCK細(xì)胞最適合用于增殖禽流感病毒[6-7]。但多數(shù)研究以貼壁培養(yǎng)為主，本研究擬對MDCK貼壁細(xì)胞進(jìn)行純懸浮馴化，以簡化將來用于大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)工藝。

采用MDCK純懸浮細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)增殖禽流感病毒制備禽流感疫苗抗原與采用雞胚制備疫苗抗原相比，不僅疫苗抗原的純度更高，而且還可以降低處理雞胚廢棄物的成本，減少生物安全危害，不僅有重要的實(shí)用價(jià)值還有社會(huì)意義。本試驗(yàn)進(jìn)行了MDCK貼壁細(xì)胞的懸浮馴化研究，以之作為基質(zhì)制備禽流感病毒疫苗抗原，為采用更安全、高效、質(zhì)量可控的細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)禽流感疫苗抗原工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒株 貼壁MDCK細(xì)胞株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，傳代至F71；H9亞型禽流感病毒BX13株由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室2013年從北京某雞場分離、純化及鑒定，毒株代號(hào)為A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)，HA效價(jià)為29，毒價(jià)為107.7EID50/0.1mL。

1.1.2 雞胚 10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液購自HyClone公司；無血清培養(yǎng)基MS01購自蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAN公司；臺(tái)盼藍(lán)染液購自Sigma公司；TPCK-Trypsin購自Gibco公司；1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備；T25、T175、T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司；250 mL三角瓶購自Corning公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 細(xì)胞搖床購自上海一恒科技有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；血球計(jì)數(shù)板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司。

2 方 法

2.1 MDCK貼壁細(xì)胞無血清培養(yǎng)基適應(yīng)馴化 MDCK貼壁細(xì)胞用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基37 ℃ 5% CO2靜置培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)良好。待細(xì)胞生長至90%，棄去培養(yǎng)液，加入含有5% FBS 的培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞長滿；逐漸減少培養(yǎng)基中FBS含量，直至細(xì)胞完全適應(yīng)含1% FBS的DMEM，用無血清培養(yǎng)基MS01替代含有血清的DMEM。

2.2 MDCK貼壁細(xì)胞的懸浮馴化 將適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的MDCK細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至250 mL三角瓶，細(xì)胞初始接種密度為5×105/mL，培養(yǎng)體積為50 mL，將三角瓶置于搖床上，轉(zhuǎn)速為100 r/min，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)。每48 h取出馴化的細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞比生長速率穩(wěn)定，進(jìn)行分瓶傳代，使細(xì)胞進(jìn)一步適應(yīng)，直至MDCK細(xì)胞完全失去貼壁的能力，以懸浮方式穩(wěn)定增殖，懸浮細(xì)胞命名為MDCK-sus。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)觀察 以臺(tái)盼藍(lán)染色法，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)活、死細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.4 禽流感病毒在MDCK懸浮細(xì)胞中的增殖 取生長良好的MDCK-sus細(xì)胞分別稀釋成密度為5×105/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL、2.0×106/mL，置于三角瓶中，每瓶的培養(yǎng)體積為50 mL，以感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.01接種H9亞型禽流感病毒BX13株，同時(shí)加入TPCK-Trypsin使其終濃度為3.5 μg/mL，接種完畢后將三角培養(yǎng)瓶放置在細(xì)胞搖床上，轉(zhuǎn)速為100 r/min, 35 ℃ 5% CO2進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；每24 h取樣測定培養(yǎng)液上清的HA價(jià)。

2.5 病毒HA效價(jià)的測定 測定方法為在96孔血凝板中每孔加入50 μL生理鹽水，第1孔加入50 μL待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，充分混勻后取50 μL加入第2孔，依次進(jìn)行倍比稀釋至第10孔，并設(shè)陽性、陰性和空白對照孔，稀釋完畢后每孔中加入50 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混合，室溫靜置20～30 min，觀察記錄結(jié)果，測定結(jié)果取以log2為底的倍數(shù)表示。

2.6 病毒EID50的測定 接毒后72 h，收獲培養(yǎng)的4個(gè)細(xì)胞密度制備的病毒液，放入-20 ℃冰箱凍融2次，取2.0×106/mL細(xì)胞密度制備的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-94個(gè)稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置于37 ℃孵育120 h，每24 h照蛋一次，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，逐個(gè)收獲48～120 h雞胚液，分別測定HA效價(jià)，HA效價(jià)不低于1∶16判為感染，按照Reed-Muench法計(jì)算EID50。

3 結(jié)果與分析

3.1 MDCK貼壁細(xì)胞無血清培養(yǎng)基適應(yīng)馴化 復(fù)蘇MDCK貼壁細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，逐漸降低血清含量至1%，低血清馴化初期，MDCK細(xì)胞生長環(huán)境從含10% FBS的DMEM過渡到5% FBS的DMEM時(shí)，細(xì)胞未表現(xiàn)明顯的不適應(yīng)，細(xì)胞生長速度未放緩，細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)肉眼可見的變化；當(dāng)馴化適應(yīng)至1% FBS條件時(shí)，MDCK細(xì)胞生長速度比10% FBS組稍慢，細(xì)胞伸展拉伸，經(jīng)過一段時(shí)間的馴化，細(xì)胞已適應(yīng)1%血清生長環(huán)境，生長速度逐漸恢復(fù)，生長狀態(tài)良好，但細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變圓趨勢，貼壁較松散，少量細(xì)胞甚至懸浮于培養(yǎng)基呈現(xiàn)懸浮生長狀態(tài)。用無血清培養(yǎng)基MS01替換含1%血清的DMEM培養(yǎng)基。

3.2 MDCK貼壁細(xì)胞的懸浮馴化 細(xì)胞無血清全懸浮馴化初期，細(xì)胞生長速率較低，經(jīng)過一段時(shí)間的傳代，細(xì)胞適應(yīng)。以5×105/mL的密度轉(zhuǎn)移細(xì)胞至250 mL三角瓶，培養(yǎng)體積為50 mL, 轉(zhuǎn)速為100 r/min, 每24 h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，在MS01無血清培養(yǎng)基懸浮馴化后期，MDCK細(xì)胞邊緣清晰，表現(xiàn)完整的單細(xì)胞懸浮生長狀態(tài)，細(xì)胞大小較均一，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象較少，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到2.5×106/mL。倍增時(shí)間為24 h，細(xì)胞活率達(dá)到99%以上，說明MDCK細(xì)胞已經(jīng)完全適應(yīng)了無血清全懸浮生長環(huán)境。

3.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)觀察 MDCK貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)馴化，細(xì)胞狀態(tài)如圖1，MDCK懸浮細(xì)胞生長曲線及對應(yīng)細(xì)胞密度如圖2和表1。

A: 正常MDCK貼壁細(xì)胞；B: 適應(yīng)低血清生長環(huán)境的MDCK細(xì)胞；C:無血清馴化后MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形態(tài)A: Normal MDCK adherent cells;B: Adapted to low serum environment MDCK cells;C: All suspension MDCK cells圖1 MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)Fig 1 Suspension culture of MDCK cells

圖2 MDCK懸浮細(xì)胞生長曲線Fig 2 The growth curve of MDCK suspension cell

培養(yǎng)時(shí)間/h024487296120細(xì)胞密度/(105·mL-1)51225446190

3.4 禽流感病毒在MDCK懸浮細(xì)胞中的增殖 以不同密度的MDCK懸浮細(xì)胞進(jìn)行H9亞型禽流感病毒BX13株的培養(yǎng)，添加3.5 μg/mL的TPCK-Trypsin，感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01，每24 h取樣觀察細(xì)胞病變，結(jié)果顯示接毒后24 h和48 h的細(xì)胞活率分別為98%和94%，72 h的細(xì)胞病變率為100%。

3.5 病毒HA效價(jià)的測定 每24 h取樣測定培養(yǎng)液HA滴度，結(jié)果見表2。

3.6 病毒EID50的測定 將H9亞型禽流感病毒BX13株以適宜的MOI和TPCK胰蛋白酶濃度接種密度為2.0×106/mL的細(xì)胞，收獲培養(yǎng)72 h接種制備的病毒液，測定培養(yǎng)液病毒含量為108.5EID50/0.1 mL(表3)。

4 討論與結(jié)論

我國獸醫(yī)生物制品行業(yè)多采用雞胚接種收獲尿囊液的方式制備禽流感疫苗抗原，但雞胚接種制備疫苗抗原存在諸如雞胚來源不固定，有外源病毒污染的可能等因素。以傳代動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗抗原，可在短時(shí)間內(nèi)增殖大量病毒，既能在短期內(nèi)提供足夠數(shù)量的疫苗抗原，又能保證產(chǎn)品的效果和安全性，同時(shí)可以降低病毒在雞胚中連續(xù)傳代可能導(dǎo)致病毒變異的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 MDCK懸浮細(xì)胞密度對H9亞型禽流感病毒抗原HA滴度的影響Tab 2 Effect of MDCK suspension cells density onHA titer of H9 subtype AIV antigen

表3 MDCK懸浮細(xì)胞制備的H9亞型禽流感病毒抗原EID50測定結(jié)果Tab 3 Results of the EID50titer of H9 subtypeAIV antigen prepared by MDCK suspension cells

有研究表明，禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中能夠增殖穩(wěn)定，適應(yīng)性較強(qiáng)[8-9]，因此以MDCK細(xì)胞作為載體制備禽流感疫苗抗原越來越受到重視，其生物安全性也已經(jīng)得到了世界各國的廣泛認(rèn)可。早期很多學(xué)者[10-11]也對微載體培養(yǎng)禽流感病毒的方式進(jìn)行了研究探索，采用微載體作為細(xì)胞附著基質(zhì)增殖MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗抗原，步驟繁瑣、污染風(fēng)險(xiǎn)大、生產(chǎn)成本高，此外，由于微載體培養(yǎng)存在微載體處理，放大困難等諸多問題因此沒有能夠在禽用疫苗領(lǐng)域推廣。

全懸浮MDCK細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可以根據(jù)需求有效擴(kuò)大細(xì)胞密度，解決疫苗產(chǎn)量低的問題，同時(shí)降低生產(chǎn)成本。本實(shí)驗(yàn)中，采用逐漸降低血清含量直至無血清培養(yǎng)的方法，最終獲得了能夠在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MDCK懸浮細(xì)胞株，此株細(xì)胞可以穩(wěn)定增殖傳代，本研究掌握了一種從貼壁細(xì)胞到懸浮細(xì)胞馴化的方法，其他貼壁細(xì)胞的馴化也可借鑒此種方法。

文獻(xiàn)報(bào)道采用類似方法懸浮馴化細(xì)胞，細(xì)胞倍增時(shí)間約48 h[12]。本實(shí)驗(yàn)所獲得的懸浮細(xì)胞倍增時(shí)間為24 h，在營養(yǎng)充足的條件下適應(yīng)高密度生長，有利于縮短細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，對規(guī)模化生產(chǎn)具有重要意義，并保持較高的活率，滿足增殖禽流感病毒的要求。

本實(shí)驗(yàn)獲得的MDCK懸浮細(xì)胞株對H9N2 BX13株禽流感病毒敏感，將該病毒株以適量的MOI和適合的TPCK胰蛋白酶濃度接種細(xì)胞密度為1.0×106/mL～2.0×106/mL的細(xì)胞液時(shí)，接毒后72 h培養(yǎng)液的HA毒價(jià)可以達(dá)到7log2～9log2，每0.1 mL的EID50達(dá)到108.5，證明該細(xì)胞株適合用于禽流感病毒抗原的制備，可以作為制備禽流感病毒抗原的候選細(xì)胞株，該細(xì)胞株對禽流感病毒的增殖能力與MDCK貼壁細(xì)胞相當(dāng)。陳宏等對重組禽流感病毒H5亞型Re-7在MDCK細(xì)胞上增殖條件的研究中報(bào)道[13]，貼壁細(xì)胞增殖病毒操作過程繁瑣，同一批次不同細(xì)胞瓶中病毒滴度存在差異，時(shí)間成本大。采用MDCK懸浮細(xì)胞繁殖病毒產(chǎn)量遠(yuǎn)高于雞胚培養(yǎng)和貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，并且同一批次病毒質(zhì)量均一穩(wěn)定，為后續(xù)生物反應(yīng)器逐級(jí)放大培養(yǎng)制備禽流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過逐步降低血清的方法使MDCK貼壁細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，獲得了能夠快速增殖并對H9亞型禽流感病毒敏感的MDCK純懸浮細(xì)胞株，該細(xì)胞株為將來規(guī)模化使用生物反應(yīng)器生產(chǎn)制備禽流感疫苗抗原奠定了基礎(chǔ)。