王秋月，賈方 綜述，王菊勇審校，

200032 上海，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 腫瘤研究所

人體正常細胞所需的能量來源主要在于葡萄糖代謝，根據(jù)組織中氧分壓的充足與否，分為線粒體的氧化磷酸化和有氧糖酵解，此外，糖代謝還包括戊糖磷酸途徑。在氧氣充足的情況下，細胞大多會將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸后進入線粒體進行氧化磷酸化，生成CO2和H2O及較多的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。但在20世紀(jì)20年代，奧托·瓦伯格發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的有氧糖酵解率遠大于正常細胞，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞也更喜歡通過有氧糖酵解途徑產(chǎn)生ATP，并非線粒體的氧化磷酸化[1],即所謂的 “Warburg效應(yīng)”。“Warburg效應(yīng)”為腫瘤細胞的生長提供了兩大優(yōu)勢：一是為腫瘤細胞的快速繁殖提供了大量碳源；二是關(guān)閉氧化通路，避免氧自由基的產(chǎn)生，逃避細胞凋亡[2]。目前對于糖酵解相關(guān)酶的研究較多，丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinases,PDKs)作為丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)的調(diào)控酶，在糖酵解中占有重要地位，因此本文主要從PDKs在腫瘤糖酵解中的功能特點、腫瘤相關(guān)調(diào)控通路及調(diào)節(jié)蛋白、與腫瘤臨床特點的相關(guān)性及相關(guān)腫瘤抑制劑研究等4方面闡述其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

PDKs為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complexes PDCs)的調(diào)節(jié)酶，共有PDK1、PDK2、PDK3和PDK4四種亞型。PDK1主要存在于心臟和胰腺,PDK2幾乎在所有的組織中表達，尤其是肝臟和腎臟,PDK3大部分存在于睪丸中,對抑制劑分子的敏感性最低，PDK4在骨骼肌、心臟和肝臟中少量存在[3]。其中PDK1被認為與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在體外研究中發(fā)現(xiàn)其對PDH-E1α絲氨酸殘基232的磷酸化也是不可或缺的[4]。

1 PDKs在惡性腫瘤糖酵解中調(diào)節(jié)的酶及競爭酶

PDKs是葡萄糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能夠促使丙酮酸、乳酸和丙氨酸進行糖異生。PDK1在糖酵解中發(fā)揮重要作用，在許多癌癥中表達上調(diào)，促進Warburg效應(yīng)和腫瘤的生長[5]，受PDK1蛋白調(diào)節(jié)的PDH是丙酮酸脫羧氧化生成乙酰輔酶A并進入線粒體三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)生物合成的門控酶，在葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用。PDH是PDCs的重要組成部分，主要有3種催化酶、1個附加結(jié)構(gòu)組成，包括丙酮酸脫羧酶、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；浮⒍淞蛐了崦摎涿负投淞蛐了崦摎涿附Y(jié)合蛋白[6]。其中E1具有三個磷酸化位點(ser232,ser293,ser300)[7]，而每個位點磷酸化的速率隨著PDKs的亞型的不同而不同[8]。PDKs介導(dǎo)的磷酸化能夠抑制PDH的活性，減少丙酮酸的脫羧氧化以調(diào)節(jié)癌細胞對氧的供需平衡，促進癌細胞的生長及抑制死亡[9]。

Yang等[10]指出是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的非小細胞肺癌患者服用靶向藥會導(dǎo)致PDK1的升高，增加PDH磷酸化，抑制PDH的活性，從而抑制腫瘤細胞線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)，促進其Warburg 效應(yīng)，而缺氧條件下EGFR靶向藥與PDK1抑制劑的聯(lián)合使用可以增強抗腫瘤效果。但也有研究顯示在EOL-1、MDA-MB 435、PC3和DU 145細胞中，PDH-E1α的磷酸化可能依賴于PDK1蛋白的表達水平，并非PDK1的酪氨酸磷酸化，在這些細胞中丙酮酸脫氫酶磷酸酶(pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP)活性相對較低，或者是PDK1以外的PDK亞型與這些細胞中的PDH-E1α磷酸化有關(guān)[11]。除此之外，Sun 等[12]研究證實PDK4的表達在一定程度上阻止轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。相反，抑制PDK4則能誘導(dǎo)與厄洛替尼耐藥相關(guān)的EMT，研究其機制發(fā)現(xiàn)是PDK4與細胞凋亡誘導(dǎo)因子相互結(jié)合，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白表達，促進厄洛替尼耐藥和活性氧的產(chǎn)生。

與PDK1競爭性調(diào)節(jié)PDH的酶為PDPs，目前對PDPs與癌癥關(guān)系的認識尚不成熟，尚未發(fā)現(xiàn)某些藥物可作用于PDP亞型進行靶點研究[13]。PDPs主要包括PDP1(負責(zé)催化和調(diào)節(jié)亞基)和PDP2(僅有催化作用),二者均負責(zé)PDH三個位點的去磷酸化[14-15]。PDK1促進PDH-E1α的磷酸化，導(dǎo)致PDCs活性降低，而PDPs負責(zé)PDH-E1α的去磷酸化。因此，兩者的相對活性決定了 PDC 復(fù)合物的活性[16]。

2 PDKs在惡性腫瘤相關(guān)通路及調(diào)控蛋白的研究

腫瘤細胞中普遍存在缺氧現(xiàn)象，其主要原因是鄰近血管的血液供應(yīng)不能滿足腫瘤的生長所需，也可能是由于異常新形成的腫瘤血管中的血流波動所致[17]。腫瘤缺氧導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)表達增多，PI3K信號通路也可調(diào)節(jié)HIF-1表達，從而調(diào)控PDK1促進PDH磷酸化的增加，使PDC活性降低，促進癌細胞的有氧糖酵解[18]。此外即使在缺乏缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1 α，HIF-1α)的情況下，PDK1的過度表達仍能激活糖酵解[19]，表明PDK1的升高獨立于HIF-1α。Pate等[20]研究表明PDK1的表達還受Wnt信號的調(diào)節(jié)，在結(jié)腸癌細胞中通過干擾Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)PDK1表達降低，細胞糖酵解過程受到抑制，抑制腫瘤發(fā)展。PDK4則受Ras信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，Ras信號傳導(dǎo)參與糖酵解、線粒體呼吸和谷氨酰胺的代謝途徑。Trinidad等[21]在Kras突變的肺癌細胞中發(fā)現(xiàn)PDK4的缺失導(dǎo)致Kras活性降低，定位細胞膜的能力下降，MAPK信號降低，發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用，而PDK4的穩(wěn)定表達增加了活化Kras在質(zhì)膜上的定位，在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細胞生長，并指出Kras突變細胞對PDK4具有依賴性。

研究證明microRNA的失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與PDKs相關(guān)酶的調(diào)控作用不盡相同。研究表明多種miRNA與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[22]，胃癌細胞中microRNA-422A表達與腫瘤大小和浸潤深度呈負相關(guān)，mir-422A過表達能夠抑制PDK2的表達，增加細胞的氧化磷酸化，抑制胃癌細胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)移；此外，mir-422A-PDK2軸影響脂肪及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的形成，降低Rb磷酸化水平，誘導(dǎo)癌細胞周期停滯[23]。肺癌細胞中microRNA-182過表達則能夠抑制PDK4的表達，導(dǎo)致PDH活性升高，促進肺癌細胞的增殖和集落形成，并指出mir-182過表達或者PDK4敲除同樣影響癌細胞的脂質(zhì)形成[24]。

癌基因(c-Myc)和雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptors，ERRS)對PDKs的高表達也產(chǎn)生影響。c-Myc作為致癌基因，在多種惡性腫瘤中高度活化，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細胞的增殖分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，并且與腫瘤的糖代謝密切相關(guān)。c-Myc與HIF-1聯(lián)合作用促進PDK1轉(zhuǎn)錄，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運體及乳酸脫氫酶等的表達，促進有氧糖酵解[25]。而ERRS除了能夠增強HIF-1和c-Myc有氧糖酵解的作用外，還能夠通過上調(diào)PDK4抑制氧化代謝[26-27]。此外，線粒體上致癌酪氨酸激酶成纖維細胞生長因子受體1能夠磷酸化并激活PDK1的多個酪氨酸磷酸化位點，誘導(dǎo)其與ATP和PDC的結(jié)合，從而促進腫瘤細胞代謝及生長[11]。

抑癌基因p53可以抑制PDK2的表達，從而增加丙酮酸進入線粒體，促進氧化呼吸,并發(fā)現(xiàn)在不同的組織和細胞中及可用碳源的不同，p53下調(diào)PDK2的機制不同。在肌肉中，p53似乎通過上調(diào)細胞色素氧化酶缺陷同源物2活性降低乙酰輔酶A，使PDK2失活；在肝臟中，p53上調(diào)谷氨酰胺酶-2，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為檸檬酸循環(huán)中間體α-酮戊二酸來加速檸檬酸循環(huán)抑制PDK2的活性[28](圖1)。

圖1 PDKs和相關(guān)蛋白的信號通路Figure 1. Signaling Pathway of Pyruvate Dehydrogenase Kinases and Related ProteinsPyruvate dehydrogenase kinases (PDKs) is regulated by C-myc and estrogen-related receptors. C-Myc, which is regulated by growth factors through Ras/MEK/ERK signaling pathway, can regulate lactate dehydrogenase A activity to promote lactate production. PDKs that inhibit the activity of pyruvate dehydrogenase enzyme activity to promote aerobic glycolysis of tumor cells is modulated by hypoxia inducible factor-1 α which is influenced by PI3K signaling pathway and hypoxia conditions. In addition, PDKs expression can be inhibited by p53 tumor suppressor gene and many microRNAs, but Wnt signaling pathway can promote it.

3 PDKs與惡性腫瘤臨床特點及耐藥機制研究

不同惡性腫瘤中，PDKs亞型的表達水平不同，Liu等[29]在非小細胞肺癌患者組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)PDK1表達較高，并與腫瘤T分期呈正相關(guān)，T分期越高，PDK1表達水平越高，而過度表達PDK1會促進癌細胞的增殖和抑制凋亡，增加癌細胞遷移率，并指出PDK1是非小細胞肺癌獨立的預(yù)后因素。Lu等[30]研究顯示PDK1在結(jié)腸癌組織表達較低，而PDK3表達較高，并且PDK3的表達與HIF-1α的表達、腫瘤的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與無病生存期呈負相關(guān)。在卵巢癌中PDK1的高表達能夠激活EGFR，與順鉑耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而抑制PDK1的表達則能夠誘導(dǎo)耐藥細胞死亡，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞的EMT，并通過生存分析指出PDK1的高表達與患者預(yù)后較差密切相關(guān)[31-32]。

PDK2是糖酵解和線粒體氧化磷酸化重要的調(diào)節(jié)因子，其在多種腫瘤組織中表達增加。Sun等[33]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PDK2能夠提高耐藥肺癌細胞對紫杉醇的敏感性，該敏感度的增加與糖酵解減少有關(guān)，但并不代表氧化磷酸化的增加，并指出紫杉醇誘導(dǎo)PDK2的表達是肺癌細胞獲得性紫杉醇耐藥的重要機制。同樣，腫瘤細胞在缺氧條件下也會促進PDK3的表達，PDK3能夠抑制細胞的凋亡并增加細胞對順鉑或紫杉醇的耐藥性，而敲除PDK3能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的糖酵解，提高腫瘤細胞對順鉑、紫杉醇、奧沙利鉑等抗癌藥物的敏感性[34]。非小細胞肺癌患者常以鉑類為基礎(chǔ)進行化療治療，然而，順鉑的使用受到其副作用的限制，特別是腎小管損傷相關(guān)的腎毒性[35]。Oh等[36]研究發(fā)現(xiàn)PDK4的表達與順鉑誘導(dǎo)的腎小管損傷明顯相關(guān)，抑制PDK4表達后能夠降低線粒體活性氧生成和減少脂肪酸氧化，減輕順鉑對腎小管的損傷。此外，抑制PDK4的表達還能增加膀胱癌對順鉑的敏感度，誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[37]。

4 PDKs抑制劑的相關(guān)研究

PDKs在腫瘤組織中的高表達與腫瘤中異常糖酵解密切相關(guān)，尤其是PDK1，它是唯一一個能夠磷酸化E1三個磷酸化位點的激酶[38]。因此，抑制PDKs(主要是PDK1)可作為抗腫瘤治療的新靶點[39]。關(guān)于PDKs抑制劑的研究較多，主要包括四類[40]，一是丙酮酸類似物，如二氯乙酸脂；二是作用于PDKs二硫辛酸口袋的化合物,如CPI6I3、Nov3r及AZD7545等；三是屬于ATP競爭型抑制劑,如Radicicol、M77976等,上述抑制劑因具有抗癌療效時劑量過大或者選擇性抑制較差等造成毒副作用較大等問題，限制其在臨床上的應(yīng)用；第4類PDK的共價抑制劑JX06，作用于PDKs半胱氨酸附近的結(jié)合口袋，對其進行共價修飾，通過改變PDK1構(gòu)象，降低其對ATP的親和力，從而能有效抑制PDK1激酶活性[41]，此類共價抑制劑有望成為惡性腫瘤PDK1抑制劑研發(fā)的候選者。Yang等[42]通過化學(xué)庫的虛擬配體的篩選以及通過酶法驗證其活性，發(fā)現(xiàn)6、7和11號化合物對PDK的抑制作用較強，在缺氧條件下，7和11號化合物能夠抑制NCI-H1975細胞增殖。此外，研究證明隨著PDKs抑制劑作用機制的不同，其代謝產(chǎn)物也不相同[43]。

隨著中藥單體藥理學(xué)研究的發(fā)展，部分中草藥單體能夠通過有效抑制PDK1活性而起抗腫瘤作用。Lee等[44]發(fā)現(xiàn)肉桂皮的水提取物主要是肉桂酸能夠抑制PDKs，提高線粒體的氧化磷酸化，增加ROS的生成，降低乳酸的產(chǎn)生，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，并且通過ROS和線粒體依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)細胞死亡，同時對正常支氣管上皮細胞的細胞毒性較小。在小鼠肺癌(Lewis lung carcinoma cells，LLC)細胞中，草玉梅有效成分在不影響PDK1表達的情況下，通過抑制PDK1的活性，降低PDHa的磷酸化，增加活性氧的產(chǎn)生及誘導(dǎo)線粒體的損傷[45]。在卵巢癌細胞中，紫云英苷能夠抑制PDK1、PDK3的表達，并能激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路促進細胞凋亡[46]?；⒄溶誂同樣可以抑制PDKs的活性，降低人乳腺癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌和小鼠LLC等癌細胞株的細胞活力[47]。Goniothalamin是番荔枝科植物中的抗癌活性成分，在黑色素瘤細胞中，可以通過降低PDK1、AKT的磷酸化起到抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的抗癌功效[48]。

綜上所述，PDKs在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位，其表達的高低對患者臨床預(yù)后的評估具有一定的指導(dǎo)意義，對PDKs抑制劑的研究也取得一定的進展。但大多數(shù)癌細胞并不單純依賴糖酵解產(chǎn)生能量，它們可協(xié)調(diào)三羧酸循環(huán)及磷酸戊糖等其他代謝途徑滿足自身生存需求[49]，因此，對糖酵解中其他酶進行篩選和確定以及發(fā)現(xiàn)及研發(fā)更多的酶抑制劑，進行多靶點的聯(lián)合治療才能更好地控制腫瘤。

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