王浩 綜述，張世文 審校

650118 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院·云南省腫瘤醫(yī)院 頭頸外一科

近年來，隨著納米醫(yī)學(xué)科技不斷發(fā)展，新型納米材料應(yīng)用于臨床研究受到廣泛關(guān)注[1]。金納米棒因具有高效的光熱轉(zhuǎn)換特性和良好的生物相容性等獨(dú)特的理化特性，已在免疫檢測、細(xì)胞成像、基因運(yùn)載以及腫瘤治療等領(lǐng)域深入研究，具有廣闊的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[2-3]。作為一種新型的高效光熱轉(zhuǎn)換貴金屬納米材料，金納米棒具有宏觀金屬粒子所不具備的物理性質(zhì)。金納米微粒本身的毒理性質(zhì)以及制備過程中所用到的毒性化學(xué)物質(zhì)，使金納米棒的生物安全性成為臨床應(yīng)用研究要解決的首要問題之一。國內(nèi)外研究顯示，將一些正常物質(zhì)制成納米級后，可能會產(chǎn)生潛在的生物毒性[2-3]。因此，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)研究中，系統(tǒng)性評估金納米棒的生物安全性顯得至關(guān)重要。

1 金納米棒的理化特性和修飾

現(xiàn)代納米技術(shù)可制備不同尺寸大小及不同形貌的金納米棒。不同大小、形貌的金納米材料的理化特性是不一樣的。金納米棒(gold nanorods，AuNRs or GNRs)在透射電鏡下的結(jié)構(gòu)示一種納米級別的棒狀金納米顆粒(圖 1A)[4]，其物理和化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，具有表面等離子震蕩特性，即當(dāng)金納米棒長橫比為3.9時，其縱向最大光吸收峰位為800nm(圖 1B),波長為800nm的近紅外激光照射金納米棒可以引起該微粒表層導(dǎo)帶電子發(fā)生相干最大震蕩。金納米棒有兩個表面等離子共振帶，橫向帶在可見光區(qū)λ=520nm處，而縱向帶在很寬的近紅外光波長范圍內(nèi)[5-6]，只要縱橫比發(fā)生微小的變化，金納米棒的縱向帶的吸收波長就會發(fā)生劇烈變化?？v向模式的共振如果發(fā)生在近紅外光譜700～900nm的波長范圍內(nèi)，能夠在生物組織中具有最大穿透深度，以及最高細(xì)胞攝取效率[7]。與其他納米材料相比，金納米棒的細(xì)胞毒性相對低[8]，可以通過Au-硫醇鍵與藥物等聚合，從而輕松實(shí)現(xiàn)功能化。利用其易于修飾的特性，可以將藥物和生物分子結(jié)合到金納米棒上輸送到身體的特定部位[9]。多項(xiàng)研究證明，金納米棒在眾多納米材料(金納米殼、金納米球、金納米籠等)中光熱轉(zhuǎn)換效率最高[10]。目前金納米棒最主要的合成法為種子生長法，以十六烷基三甲基溴化銨(cetyl-trimethyl ammonium bromide，CTAB)分子作為表面活性劑。CTAB在金納米棒的表面形成雙層有機(jī)膜，其陽性季銨基團(tuán)之間相互排斥使得金納米棒在水性介質(zhì)中相對穩(wěn)定、分散，然而，CTAB包裹的金納米棒在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)和血清中卻不穩(wěn)定[11]，且有很明顯的生物毒性[12]，這種現(xiàn)象大大地限制了金納米棒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。另外，CTAB還會阻礙生物相容性好的化合物對金納米棒表面的修飾作用[13]。解決問題的思路是替代CTAB或?qū)ζ溥M(jìn)行包被。替代CTAB的方法有：將CTAB從金納米棒懸浮液中置換到含有磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)的氯仿溶液中[14]。與CTAB-AuNRs相比，PC修飾的金納米棒細(xì)胞毒性較低，或是使用逐層聚電解質(zhì)沉積作為增強(qiáng)金納米棒表面穩(wěn)定性的手段，而非CTAB[15]。Huang等[16]發(fā)現(xiàn)后者在PBS和血清中表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，保持了光學(xué)性質(zhì)。烷硫醇對金具有高親和力，也可用于替代CTAB分子[17]。Wang等[18]通過雙相轉(zhuǎn)移配體交換，用11-巰基十一烷酸置換金納米棒表面的CTAB分子。作者認(rèn)為，相對于CTAB-AuNRs，11-巰基十一烷酸-金納米棒用于心肌肌鈣蛋白I測定的陽性參考值下限降低了5倍，從而大大提高了靈敏度。另外，金納米棒還可與磷脂-葡聚糖綴合，綴合后的金納米棒在多個pH值的溶液和血清中均表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。另一種替代方案是在CTAB的基礎(chǔ)上，再包被其他表面物質(zhì)，例如用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)硫醇化CTAB，PEG涂覆的金納米棒已廣泛用于生物學(xué)應(yīng)用。有研究表明PEG可以延長納米材料在生物體內(nèi)的循環(huán)時間[19]。PEG通過將硫醇接頭錨定在金納米棒表面，可以讓金納米棒更易功能化，可以結(jié)合肽、蛋白質(zhì)、抗體、寡糖、核酸等多種生物分子[20]。與這些物質(zhì)結(jié)合后的金納米粒子能滿足不同類型腫瘤診斷和治療的需要，從而形成圍繞金納米棒的多平臺腫瘤診治體系[21-22]。目前金納米棒的功能化修飾是研究其在生物體內(nèi)主動靶向的方法之一，方法是使用肽或抗體等小分子化合物來修飾金納米棒，使其能特異性地結(jié)合到高表達(dá)親和性配體的腫瘤組織或細(xì)胞。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體結(jié)合的金納米棒可靶向結(jié)合到高表達(dá)EGFR的膀胱癌細(xì)胞，借此可對膀胱癌進(jìn)行靶向光熱消融[23]。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)抗EGFR抗體綴合的金納米棒(抗EGFR-GNS)對目前臨床上預(yù)后很差的三陰性乳腺癌有較為理想的抑制作用，抗EGFR-GNS 介導(dǎo)的光熱治療顯著誘導(dǎo)溶酶體自噬，最終導(dǎo)致高表達(dá)EGFR的乳腺癌細(xì)胞死亡。因此，通過對金納米棒表面進(jìn)行修飾與功能化，大大降低其毒性，進(jìn)而為其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供重要基礎(chǔ)。

2 金納米棒的細(xì)胞毒性

金納米粒子粒徑在10～100nm的范圍內(nèi),能夠自由穿越細(xì)胞，在膜蛋白指導(dǎo)下通過內(nèi)吞效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞中，在細(xì)胞外分泌下排出。金納米粒子在細(xì)胞中的遷移速率與其粒徑存在聯(lián)系，粒徑越小，毒性越大，遷移效率越快，并且金納米粒子能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入特定的細(xì)胞器中，干擾細(xì)胞器功能發(fā)揮，因此金納米粒子具有潛在細(xì)胞毒性。Patra等[25]研究表明，5nm的金納米微粒可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡，抑制肺癌A549細(xì)胞增殖。而直徑10nm和20nm的金納米微粒并沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。Coradeghini等[26]研究表明,當(dāng)濃度≥50μmol/L時，5nm的金納米粒子會顯現(xiàn)出對Balb/3T3的細(xì)胞毒性，而15nm的金納米粒子卻沒有顯現(xiàn)。球形1.4nm的金納米粒子通過氧化應(yīng)激機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中的線粒體損傷甚至出現(xiàn)壞死[27]。Pan等[28]研究發(fā)現(xiàn)直徑1.4nm的金納米微粒對結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性最為明顯，可導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡，而直徑15nm的金納米微粒即使在高濃度下也是無毒的。Connor等[29]研究也發(fā)現(xiàn)，直徑18nm的金納米粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。由此可見，金納米微粒的細(xì)胞毒性與其粒徑有關(guān)，直徑越小，細(xì)胞毒性越大。因此，金納米粒子的尺寸不同，與細(xì)胞相互作用的行為也會產(chǎn)生差異。從一定程度上而言，細(xì)胞毒性與其濃度呈正相關(guān)。有研究學(xué)者利用金納米棒對肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染分析[30]，通過在96孔板中進(jìn)行肺腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)，加入不同濃度的金納米棒溶液后，利用MTT方法檢測培養(yǎng)24、48、72小時之后的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明金納米棒濃度越高，細(xì)胞安全性越低。當(dāng)金納米棒的濃度在100ppm時，在24小時內(nèi)對細(xì)胞有良好的生物安全性。隨濃度升高，細(xì)胞存活率降低，隨時間增長其細(xì)胞的存活率也會顯著降低。當(dāng)其濃度較高時會使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。有研究學(xué)者通過配體交換的方法，在金納米微粒表面引入了羥基、羧基以及甲基，分別制備三種不同表面修飾功能團(tuán)的金納米微粒，其平均粒徑為15nm，電位均為負(fù)值，通過MTT方法比較修飾后和未經(jīng)修飾金納米微粒作用HeLa細(xì)胞和MCC-803細(xì)胞之后的細(xì)胞存活率[31]。結(jié)果顯示，當(dāng)金納米微粒濃度達(dá)到197ng/mL時，表現(xiàn)為低細(xì)胞毒性。從細(xì)胞周期結(jié)果來看，沒有經(jīng)過修飾的金納米微粒對細(xì)胞G2/M周期活動具有一定的影響。在生殖毒性方面，根據(jù)Wiwantitkit[32]等的研究，化學(xué)衍生的金納米粒子使雄性生殖細(xì)胞的運(yùn)動活力降低。Taylor等[33]同樣報道了暴露于激光作用下的修飾后的金納米微粒使雄性生殖細(xì)胞的運(yùn)動活力降低。綜上所述，可以認(rèn)為金納米棒的尺寸及濃度均會影響細(xì)胞增殖，尺寸越小，濃度越高，細(xì)胞毒性越大。同時，金納米棒表面修飾物的不同對細(xì)胞毒性也會產(chǎn)生影響。

圖1 金納米棒結(jié)構(gòu)透射電鏡圖及吸收光譜圖Figure 1. Transmission Electron Microscope and Absorption Spectra of Gold NanorodsA. Transmission electron microscope of gold nanorods; B. The near-infrared laser with a wavelength of 800 nm illuminates the gold nanorods, which can cause the coherent maximum oscillation of surface-conduction electrons of particles.

3 金納米棒體內(nèi)代謝與安全性

研究發(fā)現(xiàn)，不同大小、形貌的金納米材料在生物體內(nèi)的分布、代謝過程和毒性也不盡相同[34]。金納米棒在體內(nèi)吸收、分布以及積累的生物效應(yīng)與其長徑比、表面電荷分布情況、表面積有一定聯(lián)系。當(dāng)金納米棒接觸細(xì)胞或者蛋白時，納米微粒表面會與蛋白質(zhì)發(fā)生物化反應(yīng)，形成生物-納米界面，進(jìn)而導(dǎo)致金納米棒的理化性質(zhì)發(fā)生較大變化。在臨床上將金納米棒經(jīng)外周靜脈注射到血液中時，血液中復(fù)雜蛋白復(fù)合物會在納米微粒表面形成蛋白層，進(jìn)而被血液中具有高結(jié)合率以及高濃度的蛋白包裹形成蛋白冠。蛋白冠會改變原有的金納米棒大小及其表面構(gòu)成，影響納米金微粒的吸收和運(yùn)輸。為更準(zhǔn)確分析金納米棒在體內(nèi)的分布代謝情況，研究學(xué)者選取四種不同表面修飾的長徑比為3.8的金納米棒，并以小鼠作為研究對象，通過一次性尾靜脈注射的方式使小鼠染毒，選擇幾個不同時間點(diǎn)，觀察小鼠體內(nèi)腎臟、肝臟以及脾臟組織形態(tài)變化以及有關(guān)生化指標(biāo)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有70%的金納米棒位于小鼠的肝臟中。少量金納米棒分布于脾臟、肺臟、腎臟和腦。金納米棒分布以及代謝器官主要在肝臟和脾臟。過量的金納米棒會影響機(jī)體肝臟功能，CTAB-AuNRs對于小鼠肝臟產(chǎn)生的損害最為嚴(yán)重，其毒性主要在CTAB這一結(jié)構(gòu)中，而有蛋白冠包裹的納米微粒則具有良好的生物相容性。當(dāng)CTAB-AuNRs進(jìn)入肝臟后主要聚集在肝巨噬細(xì)胞的溶酶體中，引起機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使小鼠機(jī)體初期形成脂質(zhì)過氧化，之后恢復(fù)正常。從病理學(xué)和氧化損傷指標(biāo)可以看出，除CTAB-AuNRs組的其他組中，研究都們都發(fā)現(xiàn)組織毒性效應(yīng)，可能是金等惰性金屬材料誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[35]，進(jìn)一步導(dǎo)致小鼠體內(nèi)炎癥[36]和細(xì)胞凋亡[37]。Sonavane等[38]研究發(fā)現(xiàn)，15～50nm直徑的金納米可以穿透小鼠血-腦屏障進(jìn)入腦組織并蓄積。Lasagna-Reeves等[39]研究同樣發(fā)現(xiàn)金納米在低濃度的情況下依然能透過小鼠的血腦屏障，增加了神經(jīng)元毒性損傷的風(fēng)險。還有研究報道，金納米微粒對生殖有一定毒性。用氨基化聚乙二醇修飾的金納米注射到小鼠體內(nèi)能夠引起睪酮的分泌，但不會影響小鼠的生育能力，而甲氧基聚乙二醇修飾的金納米既不影響小鼠睪酮的分泌能力，也不會影響小鼠的生育能力[40]。上述結(jié)果表明，金納米棒在體內(nèi)分布及代謝器官主要在肝臟及脾臟中，會對肝臟造成損傷，引起輕微的毒性。雖然金納米棒分布在腦組織中含量較低，但依舊會透過血腦屏障，造成神經(jīng)元的損傷。而在生殖方面，目前并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的生殖毒性。

4 總結(jié)與展望

金納米棒在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。可以嘗試將不同類型的技術(shù)(譬如細(xì)胞成像、藥物運(yùn)載和光熱治療)整合到一套納米平臺上，達(dá)到診斷與治療的整合并用。雖然我們看到金納米棒展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，但如果將其應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)研究中仍然會有很多問題值得去探索。如何安全有效地利用金納米棒進(jìn)行疾病診斷和治療，是我們科研工作者一直追求的目標(biāo)。隨著納米科技的進(jìn)步，對金納米材料復(fù)合物或納米載體進(jìn)行無毒化處理，將有利于我們開發(fā)出更多基于金納米微粒的診斷和治療方法，造福人類。

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