文/郭啟勇 魏學(xué)峰 柳國鎖 黃海碧 吳心華＊

〔1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2 金宇保靈生物藥品有限公司（國家工程實(shí)驗(yàn)室）〕

牛病毒性腹瀉/黏膜病（Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引起的一種傳染病。BVDV屬黃病毒科、瘟病毒屬[1]。BVD病程復(fù)雜，臨床和亞臨床癥狀多樣，主要表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制[2]。BVDV主要感染牛、綿羊、山羊、鹿等動(dòng)物，多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染。新生犢牛經(jīng)常因?yàn)楦篂a而死亡[3]。1999年，高雙娣等對(duì)西北地區(qū)BVD做了流行病學(xué)調(diào)查研究，結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)BVD血清學(xué)抗體陽性率55.95%[4]。2014年，李智勇等應(yīng)用ELLSA試驗(yàn)對(duì)來自內(nèi)蒙古部分地區(qū)17 個(gè)大、中、小奶牛場的2 391 份牛血清樣品進(jìn)行了BVDV抗體檢測，結(jié)果顯示，陽性率最高達(dá)100.00%，最低46.80%，平均88.90%[5]。2015年，姚偉對(duì)遼寧省部分地區(qū)的739 份血清中的BVDV抗體水平進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，平均陽性率為74.00%[6]。2015年，王曉亮等對(duì)寧夏地區(qū)BVD流行情況進(jìn)行調(diào)查，BVD血清學(xué)抗體陽性率高達(dá)64.92%[7]。2016年，何小麗等對(duì)寧夏地區(qū)疑似BVD的奶牛采取了135 份耳組織，進(jìn)行BVDV抗原檢測，陽性率最高0.50%，平均0.01%[8]。

表1 BVDV引物序列

表2 寧夏地區(qū)BVDV抗體檢測結(jié)果

1 材料與方法

1.1 材料

BVDV抗體試劑盒購自美國IDEXX公司。采集寧夏地區(qū)牧場的牛血樣1 500 份進(jìn)行抗體檢測，295份肛拭子進(jìn)行抗原檢測。

1.2 儀器

生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、組織破碎勻漿儀、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）儀和酶標(biāo)儀。

1.3 BVDV 抗體檢測

按照愛德士公司BVDV抗體檢測說明書進(jìn)行操作。北京愛德士元亨生物科技有限公司提供免費(fèi)的數(shù)據(jù)分析軟件（xChek），計(jì)算平均值、S/P比值以及提供綜合信息。試驗(yàn)結(jié)果的有效性判定，NCx≤0.25，S/P＜0.20為陰性；0.2≤S/P＜0.30為可疑；S/P≥0.30為陽性。

1.4 BVDV 抗原檢測

在生物安全柜內(nèi)處理。取大約5 mg的組織病料放置于2 mL帶有鋼珠的離心管中，用剪子盡可能剪碎，再用高通量組織研磨儀研磨、裂解組織。加入磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）進(jìn)行稀釋，取1 mL稀釋液放入2 mL離心管中，編號(hào)，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。肛拭子在超凈工作臺(tái)中加入定量的PBS，漩渦振蕩后，吸取1 mL液體到2 mL離心管中，編號(hào)，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 病料總RNA提取

采用TaKaRaMinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒提取病料組織的總RNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中的BVDV基因序列，利用DNAStar軟件MegAlign模板分析選擇Ⅰ型的5，UTR保守序列，引物由北京華大基因工程公司合成，探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，見表1。

1.4.3 擴(kuò)增體系

one step RT-PCR buffer III 12.5 μL，ExTaq HS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1.0 μL，I型1.0 μL，模板核酸2 μL，加無酶水補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增條件為：反轉(zhuǎn)錄51 ℃，15 min；94 ℃，2 min；PCR反應(yīng)94 ℃，30 s；52 ℃，30 s，45 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型曲線。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，若被檢樣品出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，且CT值為10～35，則結(jié)果為陽性；若35＜CT值≤37，則結(jié)果為可疑，即樣品需要復(fù)檢；若CT值＞37，則判定為陰性。

表3 寧夏不同地區(qū)BVD抗原檢測結(jié)果

2 結(jié)果

（1）BVDV抗體檢測

檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)BVDV抗體陽性率，最高為93.42%，平均值為87.60%。

（2）BVDV抗原檢測結(jié)果

檢測結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，陽性率最高為3.57%，平均陽性率為2.71%。

3 討論

寧夏是我國奶牛集約化養(yǎng)殖水平較高的省份之一。隨著牛場的不斷擴(kuò)繁、擴(kuò)群，BVDV的傳播也隨之增加，該病主要導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，對(duì)整個(gè)地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅。本次試驗(yàn)共檢測牛血清1 500 份，其中BVDV血清學(xué)陽性的牛有1 314 頭，抗體陽性率高達(dá)87.60%?？乖瓩z測295 份肛拭子，陽性個(gè)數(shù)為8 份，陽性率為2.71%。

BVD是全球范圍內(nèi)流行廣泛的一種傳染病，宿主比較廣泛，主要是牛，也可以感染一些野生動(dòng)物。該病毒與豬瘟具有血清學(xué)交叉反應(yīng)性，也可以感染豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。BVDV主要通過乳產(chǎn)品、公牛精液、胎盤傳播[10]。BVDV持續(xù)感染（Persistently Infected，PI）?？刹粩嗟叵颦h(huán)境中排毒，導(dǎo)致牛場永久性污染。該病的免疫抑制和持續(xù)性感染是本病長期存在于牛場而難以清除的主要原因，目前國際上主要是通過疫苗免疫來防止本病的發(fā)生與惡化。

BVDV在寧夏地區(qū)流行的主要原因：第一，寧夏地區(qū)一直有BVDV牛場的存在，一些牛場甚至存在PI牛，但并沒有被養(yǎng)殖場（戶）所重視；第二，寧夏地區(qū)不斷從國外引進(jìn)荷斯坦奶牛、西門塔爾肉牛、安格斯肉牛的胚胎和精液，其中可能攜帶BVDV；第三，寧夏地區(qū)處于甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等養(yǎng)牛大省的交界地帶，牛只調(diào)運(yùn)頻繁，加快了本病的傳播；第四，相關(guān)從業(yè)人員攜帶病毒，牛場的防疫措施不夠完善，技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)在各個(gè)牛場服務(wù)時(shí)導(dǎo)致BVDV傳播。