唐偉森，廖明媚，屈展，張珂，張宇，周建華，劉蔚東

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.基本外科 2.病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者中Lynch綜合征約占2%～3%[1-2]，其主要特點(diǎn)是發(fā)生家族性結(jié)直腸腫瘤或腸外腫瘤。DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair，MMR）發(fā)生種系突變是Lynch綜合征患者發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見(jiàn)發(fā)生突變的4個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因。MMR的主要功能是糾正DNA復(fù)制時(shí)單個(gè)核苷酸的錯(cuò)誤配對(duì)，其發(fā)生突變引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）[3]，DNA復(fù)制不能正常進(jìn)行或遺傳信息發(fā)生錯(cuò)誤傳遞。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸患者腫瘤組織標(biāo)本的4個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因，以及配合MLH1啟動(dòng)子甲基化和BRAF突變分析已逐漸推薦應(yīng)用于臨床散在性MMR缺失的篩查[4]。PMS2參與DNA錯(cuò)配修復(fù)并且在腫瘤易感性中起作用，其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與MLH1結(jié)合形成異源二聚體hMutL-a（hMLH1/hPMS2），識(shí)別錯(cuò)配位點(diǎn)，參與錯(cuò)配修復(fù)[5]。本研究旨在分析結(jié)直腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的表達(dá)狀態(tài)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與血清CEA、CA19-9、CA125水平的關(guān)系及相關(guān)性，期以為臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普通外科2017年5月—2018年7月確診的結(jié)直腸癌切除手術(shù)腫瘤組織標(biāo)本1 023例及相應(yīng)患者的血清腫瘤標(biāo)記物CEA、CA19-9、CA125，其中結(jié)腸癌腫瘤組織520例，直腸癌腫瘤組織503例。所有患者中男595例，女428例；年齡為25～89歲，平均年齡為59.4歲。

1.2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。HE染色切片，經(jīng)2名以上病理醫(yī)師診斷。免疫組化使用北京中杉金橋PV6000型免疫組化試劑盒，步驟如下：石蠟切片脫蠟、水化后PBS沖洗，EDTA高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，加入一抗，37 ℃孵育1 h，加酶標(biāo)二抗37 ℃孵育30 min，加DAB顯色液顯色約4 min，顯微鏡下觀察控制顯色程度，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。PMS2抗體購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。PMS2蛋白定位于細(xì)胞核。以腫瘤周?chē)恼Ｉ掀ぜ?xì)胞、腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞作為內(nèi)對(duì)照，如內(nèi)對(duì)照陽(yáng)性則納入研究，如內(nèi)對(duì)照陰性則剔除。PMS2蛋白陰性表達(dá)即腫瘤細(xì)胞核與內(nèi)對(duì)照相比無(wú)著色（圖1A），PMS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)即腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)與內(nèi)對(duì)照一致的著色（圖1B）。

圖1 PMS2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)（SP，標(biāo)尺100 μm） A：PMS2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中陰性表達(dá)；B：PMS2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件分析，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌腫瘤組織和直腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白的表達(dá)及關(guān)系

結(jié)腸癌腫瘤組織中，PMS2蛋白陰性表達(dá)率為14.0%（73/520），直腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白陰性表達(dá)率為2.9%（13/503），結(jié)腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白陰性表達(dá)率明顯高于直腸癌（P＜0.000 1）（表1）。

表1 結(jié)腸癌與直腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)比較

2.2 結(jié)腸癌腫瘤組織中PMS2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的陰性表達(dá)者與陽(yáng)性表達(dá)者的周?chē)窠?jīng)侵犯陽(yáng)性率分別為4.1%（3/73）、14.8%（66/447），陰性表達(dá)者周?chē)窠?jīng)侵犯陽(yáng)性率明顯低于陽(yáng)性表達(dá)者（P=0.009 1）；結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的陰性表達(dá)者與陽(yáng)性表達(dá)者的腫瘤最大徑≥5 cm的比例分別為69.9%（51/73）、47.2%（211/447），陰性表達(dá)者腫瘤最大徑≥5 cm的比例明顯高于陽(yáng)性表達(dá)者（P=0.000 3）；結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的陰性表達(dá)者的腫瘤細(xì)胞低分化的比例明顯高于PMS2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)者（P=0.000 6）；兩者在性別、年齡、脈管侵犯陽(yáng)性率、系膜內(nèi)淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生率及T分期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

2.3 結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與血清CEA、CA19-9、CA125水平的關(guān)系及其相關(guān)性

結(jié)腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白的陰性表達(dá)和陽(yáng)性表達(dá)者血清CEA、CA19-9、CA125水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；且兩者無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表3）。

表2 結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的表達(dá)狀態(tài)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 結(jié)腸癌腫瘤組織PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與血清CEA、CA19-9、CA125水平的關(guān)系及其相關(guān)性

2.4 直腸癌腫瘤組織中PMS2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

直腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的陰性表達(dá)者與陽(yáng)性表達(dá)者T3+4分期比率分別為 100.0%（13/13）、72.7%（356/490），陰性表達(dá)者T3+T4分期比率明顯高于陽(yáng)性表達(dá)者（P=0.024 6）；兩者在性別、年齡、腫瘤大小、脈管侵犯陽(yáng)性率、神經(jīng)侵犯率、系膜內(nèi)淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生率及腫瘤細(xì)胞低分化比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表4）。

表4 直腸癌腫瘤組織PMS2蛋白的表達(dá)狀態(tài)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 直腸癌腫瘤組織PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與血清CEA、CA19-9、CA125水平的關(guān)系及其相關(guān)性

直腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白的陰性表達(dá)者與陽(yáng)性表達(dá)者的血清CA19-9水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但PMS2蛋白表達(dá)和血清CA19-9水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.162 3，P＜0.01）；兩者在血清CEA、CA125水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩者無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表5）。

表5 直腸癌腫瘤組織PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與血清CEA、CA19-9、CA125水平的關(guān)系及其相關(guān)性

3 討 論

DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是指在含有錯(cuò)配堿基的DNA分子中，使核苷酸序列恢復(fù)正常的修復(fù)方式。DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是一個(gè)嚴(yán)格的校對(duì)者，鑒別及糾正復(fù)制時(shí)錯(cuò)配的DNA堿基，保證基因組的完整性和穩(wěn)定性，避免遺傳物質(zhì)發(fā)生突變。錯(cuò)配修復(fù)基因通過(guò)編碼錯(cuò)配修復(fù)蛋白修正這些錯(cuò)誤。錯(cuò)配修復(fù)基因突變導(dǎo)致其蛋白表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生缺陷而失去錯(cuò)配修復(fù)功能，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制錯(cuò)誤，引起細(xì)胞增殖及異常分化增加，最終導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[6]。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的主導(dǎo)蛋白[7-8]，4種蛋白均正常表達(dá)即為錯(cuò)配修復(fù)正常（pMMR），至少有1項(xiàng)表達(dá)缺失為錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失（dMMR）。PMS2基因是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中的一個(gè)較為重要的基因，其在結(jié)直腸癌中有一定比例的陰性表達(dá)[9]。

P M S 2基因位于染色體7 p 2 2，c D N A有2586bp。PMS2基因突變最初描述于遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌（Lynch綜合征）[10]。PMS2參與DNA錯(cuò)配修復(fù)并且在腫瘤易感性中起作用，其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與MLH1結(jié)合形成異源二聚體hMutL-a（hMLH1/hPMS2），識(shí)別錯(cuò)配位點(diǎn)，參與錯(cuò)配修復(fù)[5]。有證據(jù)表明PMS2蛋白和其它一些錯(cuò)配修復(fù)蛋白是多功能的，可以影響細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡[11]。

目前的研究熱點(diǎn)多集中在MMR表達(dá)水平在左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌與直腸癌之間的差異[12]。本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌腫瘤組織中PMS2蛋白表達(dá)陰性病例的比例明顯高于直腸癌腫瘤組織。結(jié)腸與直腸的胚胎發(fā)育和生理環(huán)境及功能存在差異[13]，腫瘤組織中PMS2蛋白表達(dá)在結(jié)腸與直腸有明顯差異可能與之有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，dMMR的腫瘤組織常有較差的分化[14]，但有較好的預(yù)后[15-17]，可能與對(duì)化療反應(yīng)不同有關(guān)[14]。但少見(jiàn)單獨(dú)PMS2蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系報(bào)道，Ten Broeke等[18]報(bào)道PMS2相關(guān)Lynch綜合征患者與其它錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷所致Lynch綜合征不同，PMS2相關(guān)結(jié)直腸癌腫瘤組織的KRAS突變率高于MLH1和MSH2。本研究中PMS2蛋白陰性表達(dá)者T3+T4期比例和腫瘤細(xì)胞分化程度差比例明顯高于陽(yáng)性表達(dá)者，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道dMMR腫瘤組織有較差分化相符。本研究結(jié)果顯示直腸癌腫瘤組織的PMS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)者周?chē)窠?jīng)侵犯率明顯高于陰性表達(dá)者，腫瘤組織侵犯神經(jīng)，提示常更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。最新的文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道，相比于結(jié)直腸癌的pMMR腫瘤組織，dMMR的腫瘤組織的PD-L1表達(dá)率更高，微衛(wèi)星高不穩(wěn)定的腫瘤組織的PD-L1表達(dá)率要顯著高于微衛(wèi)星穩(wěn)定的患者[21]，提示dMMR及微衛(wèi)星高不穩(wěn)定的腫瘤組織可能對(duì)抗PD-1/L1免疫治療有更多的獲益[20]。本研究顯示，大部分直腸癌腫瘤組織標(biāo)本的PMS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，大部分相應(yīng)患者血清CA19-9表達(dá)陰性，PMS2蛋白的表達(dá)與CA19-9水平呈負(fù)相關(guān)。

本研究局限性為近1年多的患者（相當(dāng)一部分未滿1年），因此需獲取長(zhǎng)期隨訪結(jié)果有利于進(jìn)一步了解預(yù)后情況。本研究為回顧性研究，在此期間主要收集了1 023例結(jié)直腸癌的病例資料，同期的腺瘤非癌病例有數(shù)萬(wàn)例，并未行腺瘤組織樣本的MMR表達(dá)分析。

總之，PMS2蛋白表達(dá)狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理因素密切相關(guān)，可能對(duì)于指導(dǎo)臨床診療和預(yù)后分析有一定價(jià)值。