胃癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，中國(guó)的發(fā)病率約為27.77/10萬(wàn)，病死率約25.27/10萬(wàn)[1]。早期胃癌患者常無(wú)自覺(jué)癥狀，發(fā)病隱匿，這是疾病最終進(jìn)展至晚期并導(dǎo)致患者預(yù)后較差的重要原因。血清學(xué)標(biāo)志物可為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)診療贏得寶貴時(shí)間，已逐漸引起人們重視。研究發(fā)現(xiàn)，糖類抗原724(CA724)、糖類抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)PTENP1在胃癌患者體內(nèi)異常表達(dá)，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)[2-5]。本研究納入110例胃癌患者、108例胃良性疾病患者和120例健康體檢者，檢測(cè)并比較了3組研究對(duì)象的血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1的表達(dá)水平，分析這四項(xiàng)指標(biāo)與胃癌的臨床病理特征的相關(guān)性及臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2013年3月至2015年2月經(jīng)病理學(xué)確診的110例胃癌患者，其中乳頭狀腺癌57例，黏液腺癌28例，管狀腺癌25例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期60例，Ⅲ～Ⅳ期50例。胃癌的分期參照美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)第8版TNM分期系統(tǒng)[6]。同期選取108例胃良性疾病患者(胃平滑肌瘤38例、胃腺肌瘤20例、胃纖維瘤19例、胃潰瘍31例)和120例健康體檢者。3組研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙史、飲酒史差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究的開(kāi)展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 3組研究對(duì)象的臨床基本資料

1.2 血清CA724、CA19-9、CEA與lncRNA PTENP1表達(dá)水平檢測(cè)

研究對(duì)象禁食10 h以上，次日清晨由醫(yī)護(hù)人員使用含促凝劑的采血管抽取靜脈血5 mL，血液標(biāo)本經(jīng)12 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，收集上層血清。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CA724、CA19-9、CEA表達(dá)水平，檢測(cè)原理為：采用化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯類化合物直接標(biāo)記CA724、CA19-9、CEA抗體，分別與標(biāo)本中CA724、CA19-9、CEA特異性結(jié)合，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀——Archetect j2000sr全自動(dòng)免疫分析儀(美國(guó)Abbott公司)進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，而后根據(jù)CA724、CA19-9、CEA標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，并采用配套的原裝進(jìn)口試劑盒。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)lncRNA PTENP1的相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)試劑購(gòu)自中國(guó)Takara公司，反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。qPCR反應(yīng)循環(huán)條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用PrimerPremier 5.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，引物合成由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司提供，引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔCt法計(jì)算lncRNA PTENP1的相對(duì)表達(dá)量。△Ct值= PTENP1 Ct值-GAPDH Ct值。

采用英國(guó)朗道公司腫瘤高值、低值質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，判斷標(biāo)準(zhǔn)為Westgard多規(guī)則分析，并分析本次實(shí)驗(yàn)血清CA724、CA19-9、CEA與lncRNA PTENP1檢測(cè)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)，用以評(píng)估檢測(cè)的重復(fù)性和精確度。

表2 引物序列

1.3 隨訪

依據(jù)納入研究的時(shí)間，對(duì)胃癌患者進(jìn)行40個(gè)月的電話隨訪，記錄患者的生存時(shí)間。隨訪終點(diǎn)為：(1)40個(gè)月內(nèi)患者死亡；(2)40個(gè)月內(nèi)患者退出該項(xiàng)研究；(3)40個(gè)月隨訪結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組血清CA724、CA19-9、CEA與lncRNA PTENP1表達(dá)水平比較

血清CA724、CA19-9、CEA與lncRNA PTENP1檢測(cè)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)值小于5%，提示實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性和精確度。與胃良性疾病組和健康體檢組相比較，胃癌組的血清CA724、CA19-9和CEA表達(dá)水平均升高，血清lncRNA PTENP1水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。而胃良性疾病組與健康體檢組間血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 3組研究對(duì)象血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1水平比較

注：與胃癌組相比，aP<0.05

2.2 血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

以胃癌患者血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1表達(dá)水平的中位數(shù)分別將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。相比于CA724、CA19-9、CEA低表達(dá)和lncRNA PTENP1高表達(dá)組，CA724、CA19-9、CEA高表達(dá)和lncRNA PTENP1低表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率、Ⅲ～Ⅳ期患者所占比例均升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4和表5。Spearman相關(guān)性分析顯示，血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表4 血清CA724和CA19-9表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

表5 血清CEA和lncRNA PTENP1水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

表6 血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.3 ROC曲線分析結(jié)果

血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1區(qū)分胃癌組與胃良性病變組及健康體檢組的ROC結(jié)果見(jiàn)表7和圖1，4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的診斷臨界值分別為2.82 U/mL、30.14 U/mL、2.25 ng/mL和26.91(-log)。當(dāng)聯(lián)合檢測(cè)CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1時(shí)，敏感度顯著提高至96.1%。

表7 血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1對(duì)胃癌鑒別診斷的ROC結(jié)果

圖1 血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1 對(duì)胃癌鑒別診斷的ROC曲線分析

2.4 生存分析

110例胃癌患者依據(jù)CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1水平的中位數(shù)分別被分為高水平組與低水平組。與高lncRNA PTENP1組相比，低lncRNA PTENP1組患者的生存時(shí)間顯著降低(log-rankP=0.002，見(jiàn)圖2A)；與低CA19-9組相比，高CA19-9組患者的生存時(shí)間顯著降低(log-rankP=0.039，見(jiàn)圖2B)；與低CA724組相比，高CA724組患者的生存時(shí)間顯著降低(log-rankP<0.001，見(jiàn)圖2C)；與低CEA組相比，高CEA組患者的生存時(shí)間也顯著降低(log-rankP=0.010，見(jiàn)圖2D)。

圖2 各組生存情況分析 A lncRNA PTENP1組 B CA19-9組 C CA724組 D CEA組

3 討論

由于胃癌的早期篩查尚未在中國(guó)普及，導(dǎo)致一部分胃癌患者在就診時(shí)已處于晚期。目前對(duì)晚期胃癌尚無(wú)有效的治療方法，因而其5年生存率極低。尋找可靠的早期篩查生物學(xué)指標(biāo)是提高胃癌患者生存率的重要方法。

CEA是一種具有胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，在胃腸道惡性腫瘤及乳腺癌、肺癌等腫瘤患者體內(nèi)表達(dá)升高，對(duì)惡性腫瘤的診斷具有提示作用[7]。CA19-9是糖抗原的一種，其表達(dá)升高多提示有胰腺炎、肝硬化、糖尿病、消化道腫瘤可能。CA724是一種較新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)胃腸道腫瘤的判斷具有潛在價(jià)值，但目前在臨床上的應(yīng)用較少[8]。陳鐘等[9]對(duì)41例胃癌患者和40例健康對(duì)照的血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的血清CA19-9、CA724和CEA水平明顯高于健康人群。王梅等[10]對(duì)92例胃癌患者和45例對(duì)照者血清CEA、CA724水平的分析結(jié)果表明，胃癌患者血清CEA、CA724水平、陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，兩者聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率顯著高于單項(xiàng)檢測(cè)(P<0.05)，且兩者的表達(dá)水平隨胃癌TNM分期和疾病進(jìn)展呈逐級(jí)升高趨勢(shì)。國(guó)外研究亦有類似報(bào)道[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清CA724、CA19-9、CEA表達(dá)水平均顯著高于胃良性疾病患者和健康體檢者，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相一致[9-12]。進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清CA724、CA19-9、CEA水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均具有顯著相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)與王梅等[10]的研究結(jié)果相符。生存分析結(jié)果也進(jìn)一步提示，高水平CA724、CA19-9、CEA與胃癌患者的不良預(yù)后有密切聯(lián)系。

除腫瘤標(biāo)志物外，lncRNA PTENP1也被證實(shí)在胃癌患者體內(nèi)異常表達(dá)，與胃癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。Dong等[13]通過(guò)檢測(cè)110例胃癌患者血漿lncRNA PTENP1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，胃癌患者血漿lncRNA PTENP1表達(dá)水平顯著降低。Guo等[14]通過(guò)基因重組方法構(gòu)建lncRNA PTENP1的siRNA載體，并感染人SGC7901及MKN45胃癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA PTENP1表達(dá)后可顯著降低胃癌細(xì)胞系中抑癌基因PTEN的表達(dá)，表明lncRNA PTENP1在抑制胃癌細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Zhang等[15]的研究證實(shí)，lncRNA PTENP1可通過(guò)影響胃癌組織血管形成微環(huán)境，抑制腫瘤組織新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移；此外，該研究提示lncRNA PTENP1可通過(guò)“海綿作用”吸附并抑制miR-106b和miR-93發(fā)揮功能，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PTENP1水平在Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯降低，提示低水平的lncRNA PTENP1與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。

此外，本研究還探究了聯(lián)合檢測(cè)血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1水平對(duì)胃癌的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合4項(xiàng)指標(biāo)可將胃癌診斷的敏感度提高至96.1%，高于單獨(dú)檢測(cè)CA724(91.2%)、CA19-9(63.1%)和CEA(66.2%)。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)血清CA724、CA19-9、CEA和lncRNA PTENP1水平對(duì)胃癌的診斷和預(yù)后具有一定價(jià)值，有望為胃癌的臨床診療路徑提供新的思路。