克羅恩病(CD)以非特異性的炎性損傷、肉芽腫、結(jié)腸局灶性為主要病變特征[1]。CD患者通常有腹痛、腹瀉、便血等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-215的上調(diào)與自噬等信號(hào)通路相關(guān)[3]。自噬參與了CD的炎性反應(yīng)和組織損傷，抑制自噬有助于緩解CD癥狀[4-5]。因此推測(cè)，miR-215可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬對(duì)CD起到緩解作用。本研究通過(guò)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)建立小鼠CD模型，探究miR-215在CD中的作用及對(duì)自噬的調(diào)控作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量為(20±2)g，6～8周齡，由北京軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)小鼠置于溫度為(21±2)℃、濕度為(55±10)%、12 h/12 h明暗周期的環(huán)境中，保證每只實(shí)驗(yàn)小鼠可以自由地接觸水源和食物。

1.2 試劑與儀器

試劑：TNSB(美國(guó)Sigma公司)，白細(xì)胞介素-8(IL-8)、IL-10、ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，基因組DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(日本TaKaRa公司)，SYBR Green(美國(guó)Amibion公司)，Lenti-miR-215(上海吉瑪公司)，HE染色試劑盒(武漢博士德公司)，Beclin1多克隆抗體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體、IL-1β多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司)，髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司)。

儀器：酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，水平電泳槽(北京六一儀器廠)，電泳儀(北京六一儀器廠)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

選取48只小鼠，予以禁食不禁水12 h，乙醚麻醉，隨機(jī)分成兩組，空白組(A組)和模型組，A組12只灌腸給予50%的乙醇溶液100 μL，模型組36只肛門(mén)注入濃度為2.5%的TNBS乙醇溶液100 μL，注射完畢后倒提小鼠30 s防止液體流出。造模后每日觀察小鼠的體質(zhì)量、排便情況、進(jìn)食情況以及精神狀態(tài)[6]。3 d后，空白組隨機(jī)選取2只，模型組隨機(jī)選取6只處死，取結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，判斷TNBS誘導(dǎo)的小鼠CD模型構(gòu)建成功與否。將造模成功的30只小鼠隨機(jī)分成3組，設(shè)為T(mén)NBS組(B組)、Lenti-Scramble(C組)和Lenti-miR-215(D組)，每組各10只。A組灌腸給予100 μL生理鹽水，B組灌腸給予100 μL生理鹽水，C組灌腸給予100 μL慢病毒載體，D組灌腸給予100 μL表達(dá)miR-215的慢病毒載體。連續(xù)灌腸2周，每周2次。

2.2 小鼠疾病活動(dòng)度的評(píng)價(jià)方法

小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)估：每日觀察小鼠的體質(zhì)量和糞便，行糞便潛血實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表1進(jìn)行DAI評(píng)分。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3，體質(zhì)量減失率(%)=(實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量-造模后體質(zhì)量)/實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量×100%[7]。

表1 小鼠DAI評(píng)分

2.3 ELISA法檢測(cè)血清IL-8、IL-10、MPO的水平

入組小鼠麻醉后下腔靜脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-8和IL-10、MPO水平，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 HE染色檢測(cè)結(jié)腸組織病理改變

將在多聚甲醛中固定過(guò)的結(jié)腸組織制作成4 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行HE染色，觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸組織內(nèi)miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA的表達(dá)

用Trizol試劑提取結(jié)腸組織內(nèi)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各基因的引物序列見(jiàn)表2，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性10 min，隨后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果。

表2 引物序列

2.6 Western blotting檢測(cè)結(jié)腸組織內(nèi)Beclin1蛋白、TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)

使用含PMSF的RIPA裂解液制備蛋白樣品，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，上樣。60 V電泳30 min，80 V電泳90 min，橫流200 mA轉(zhuǎn)膜100 min。轉(zhuǎn)膜完畢后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，PBST洗3次，每次10 min，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，然后再用PBST洗3遍，然后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠DAI評(píng)分比較

A組、B組、C組、D組DAI評(píng)分分別為0.25±0.12、3.52±0.55、3.34±0.67、1.55±0.32，四組間相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.30，P<0.001)。B組、C組、D組DAI評(píng)分高于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比，C組DAI評(píng)分沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，D組DAI評(píng)分顯著降低(P<0.05)。與C組相比，D組DAI評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

3.2 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)觀察

由圖1可知，A組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，分層清晰，上皮細(xì)胞排列緊密，杯狀細(xì)胞連續(xù)分布，腺管結(jié)構(gòu)完整，固有層沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組結(jié)腸組織上皮細(xì)胞數(shù)量減少，腺體缺失，黏膜層破壞嚴(yán)重，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)黏膜固有層。C組結(jié)腸組織表現(xiàn)出與B組類似的炎性癥狀。D組結(jié)腸組織切片與A組類似，結(jié)腸組織細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，層次清晰。

圖1各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)觀察 HE ×200A空白組的結(jié)腸組織BTNBS組的結(jié)腸組織CLenti-Scramble組的結(jié)腸組織DLenti-miR-215組的結(jié)腸組織

3.3 各組小鼠結(jié)腸組織IL-8、IL-10和MPO水平比較

A組、B組、C組、D組結(jié)腸組織IL-8、IL-10和MPO水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.64、7.25、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組結(jié)腸組織IL-8、MPO水平均升高而IL-10水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比，C組結(jié)腸組織IL-8、MPO、IL-10水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組結(jié)腸組織IL-8、MPO水平均顯著降低，IL-10水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與C組相比，D組結(jié)腸組織IL-8、MPO水平顯著降低而IL-10水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3.4 各組小鼠結(jié)腸組織miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表達(dá)水平的比較

A組、B組、C組、D組結(jié)腸組織miR-215和Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.73、7.25、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組、D組結(jié)腸組織miR-215 mRNA表達(dá)水平降低，B組、C組Beclin1 mRNA表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比，C組結(jié)腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組結(jié)腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與C組相比，D組結(jié)腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織IL-8、IL-10和MPO水平的比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

表4 各組小鼠結(jié)腸組織miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表達(dá)水平的比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

3.5 各組小鼠結(jié)腸組織Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表達(dá)水平的比較

A組、B組、C組、D組結(jié)腸組織Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.36、26.73、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組結(jié)腸組織Beclin1蛋白表達(dá)水平降低，TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平均升高，D組TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與B組相比，C組結(jié)腸組織Beclin1、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組結(jié)腸組織Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與C組相比，D組結(jié)腸組織Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高，TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織Beclin1蛋白、 TNF-α蛋白和IL-1β蛋白的表達(dá)表5 各組小鼠結(jié)腸組織Beclin1、TNF-α和 IL-1β蛋白表達(dá)水平的比較()

組別例數(shù)Beclin1TNF-αIL-1βA組100.42±0.120.16±0.140.16±0.07B組100.20±0.09a0.69±0.13a0.71±0.16aC組100.17±0.05a0.75±0.15a0.76±0.23aD組100.33±0.06bc0.40±0.09abc0.41±0.17abc

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

4 討論

炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和CD兩種類型。CD是一種慢性的胃腸道肉芽腫炎性反應(yīng)，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家較高，在中國(guó)則呈逐年升高趨勢(shì)[8-9]。有研究表明，miR-215可能是預(yù)測(cè)CD的生物學(xué)標(biāo)志物[10]，但是miR-215在CD中的作用機(jī)制仍待探究。

為了研究miR-215對(duì)CD的影響，本實(shí)驗(yàn)首先采用TNBS建立小鼠CD模型。小鼠DAI評(píng)分結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠DAI評(píng)分顯著升高，結(jié)腸組織HE染色顯示上皮細(xì)胞數(shù)量減少，腺體缺失，黏膜層破壞嚴(yán)重，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)黏膜固有層，促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平顯著升高，而抗炎因子IL-10水平顯著降低，表明CD模型構(gòu)建成功。通過(guò)比較正常小鼠和CD小鼠結(jié)腸組織中miR-215的水平，發(fā)現(xiàn)CD小鼠中miR-215的表達(dá)水平顯著降低，表明miR-215可能參與CD的發(fā)展。為了進(jìn)一步研究miR-215對(duì)CD的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌腸給予CD小鼠表達(dá)miR-215的腺病毒載體后，發(fā)現(xiàn)miR-215的高表達(dá)可以顯著降低小鼠的DAI評(píng)分，并且顯著改善結(jié)腸組織的病理學(xué)改變，同時(shí)會(huì)使促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平顯著降低，抗炎因子IL-10水平顯著升高，表明miR-215確實(shí)與CD存在密切的聯(lián)系。

Beclin1也稱Atg6，是哺乳動(dòng)物中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可以調(diào)節(jié)自噬的基因，是啟動(dòng)自噬發(fā)生的一個(gè)重要開(kāi)關(guān)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Atg16L1基因敲除會(huì)導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)和腸道上皮細(xì)胞發(fā)生損傷，自噬基因Atg2A突變也可能與CD的發(fā)生有關(guān)[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-215過(guò)表達(dá)可以使小鼠結(jié)腸組織Beclin1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高，表明過(guò)表達(dá)miR-215可能是通過(guò)Beclin1介導(dǎo)的自噬通路發(fā)揮改善CD的作用的。Paul等[16]發(fā)現(xiàn)，自噬可以減少I(mǎi)L-1β等促炎因子的釋放。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-215過(guò)表達(dá)可以使CD小鼠Beclin1 mRNA及其蛋白水平升高，增加結(jié)腸組織自噬的同時(shí)，降低促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平，并升高抗炎因子IL-10的表達(dá)水平，表明自噬水平的升高可以減少相關(guān)促炎因子的釋放，升高抗炎因子的水平，從而減輕CD過(guò)程中的炎性損傷程度。

綜上所述，miR-215的過(guò)表達(dá)對(duì)于TNBS誘導(dǎo)的CD具有保護(hù)作用，而且該作用與Beclin1介導(dǎo)的自噬通路有關(guān)。