張愛華

年齡相關性白內障是一種老年多發(fā)性眼病，由晶狀體功能紊亂引起，嚴重者可致盲，嚴重影響患者的生活質量。隨著年齡增加，氧化應激、紫外線損傷、鈣蛋白酶激活、細胞凋亡等因素已被證明與內障發(fā)病具有密切聯(lián)系[1,2]。然而到目前為止，對于白內障發(fā)病機制的認識不統(tǒng)一，仍需進一步探索。

αB-晶狀體蛋白(αB-crystallin，編碼基因CRYAB)是晶狀體組織中最關鍵的蛋白之一，其基本功能是識別并結合有聚集傾向的非天然蛋白質或蛋白質折疊過程中的中間產(chǎn)物，穩(wěn)定靶蛋白分子的構象，防止形成不可逆的蛋白質聚集產(chǎn)物[3～5]。因此，αB-crystallin對細胞內蛋白質的數(shù)量和質量的穩(wěn)定以及細胞內環(huán)境的穩(wěn)定有著十分重要的作用，近年來發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白參與多種細胞生理和應激過程，表現(xiàn)出某種抗組織細胞損傷的保護功能，在白內障中發(fā)揮關鍵保護作用[6, 7]。

microRNA(miRNA)已被發(fā)現(xiàn)在白內障晶狀體上皮細胞氧化中發(fā)揮關鍵作用[8]。例如miR-138通過下調人晶狀體上皮細胞抗氧化應激的能力，抑制人晶狀體上皮細胞增殖和修復參與年齡相關性白內障的發(fā)展[8]。另外，αB-crystallin已被證明可作為miRNA的靶基因，對腫瘤細胞發(fā)揮調控作用[9]。miR-513b-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的促凋亡調控分子，在睪丸癌細胞中發(fā)揮多種關鍵功能[10]。通過嚴格的生物信息學分析，筆者推測αB-crystallin可能在晶狀體組織中作為miR-513b-5p的靶基因發(fā)揮作用。本研究擬在年齡相關性白內障組織和晶狀體上皮細胞中探究miR-513b-5p是否通過調控αB-crystallin對細胞凋亡和氧化應激發(fā)揮作用。

材料與方法

1.臨床資料與樣本：收集2016年6月～2018年3月，復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院眼科住院行混濁晶體摘除的白內障患者15例(白內障組)。白內障組納入標準及入組例數(shù)：除白內障外無其他眼科病變，無腫瘤發(fā)生；實際納入男性9例，女性6例，平均年齡64.80歲。對照組(control組)納入標準及入組例數(shù)：復旦大學中山醫(yī)院因受傷行眼球摘除的健康者透明晶狀體組織10份(男、女性來源各5份，平均年齡61.25歲)。白內障組與對照組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，說明兩組間具有可比性。兩組晶狀體組織特征：對照組所有晶狀體均呈清亮狀，無混濁，白內障組所有晶狀體組織呈現(xiàn)明顯灰白色渾濁。研究資料中所涉及的所有志愿者均已簽訂知情同意書。

2.細胞培養(yǎng)：人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細胞使用DMEM培養(yǎng)液和10%的FBS常規(guī)培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

3.細胞處理和細胞轉染：待細胞融合率達到80%后，將細胞濃度調整為1×106，對SRA01/04細胞轉染miR-513b-5p的擬似物mimic或者陰性controlmimic-NC 24h(上海碧云天生物技術有限公司)。單獨使用H2O2誘導1h，或者SRA01/04細胞轉染miR-513b-5p抑制劑inhibitor或陰性controlinhibitor-NC 24h的基礎上繼續(xù)使用400μmol/L H2O2誘導1h。聯(lián)合使用擬似物mimic和αB-crystallin穩(wěn)定過表達質粒cDNA3.1-αB-crystallin(c-CRYAB)共轉染細胞(mimic+c-CRYAB)，或者與陰性controlcDNA3.1-null(c-null)共轉染細胞(上海碧云天生物技術有限公司)。

4.實時定量PCR(RT-qPCR)：對各組細胞或者組織進行裂解，TRIzol法抽提細胞總RNA，M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA，miRNA反轉錄使用miScript反轉錄試劑盒合成。cDNA特定RNA產(chǎn)物的產(chǎn)量檢測使用SYBR?Green Master Mix，U6(miRNA)為內參對miR-513b-5p的表達量進行標準化處理。反應體系(20μl)：10μl SYBR，2.0ng模板cDNA，正反向引物濃度均為20μmol/L，體積為0.8μl，最終使用滅菌蒸餾水加至20μl。PCR過程：40個循環(huán)， 94℃，1min；54℃，1min；聚合72℃，1min；延伸 72℃，7min。引物序列見表1。miR-513b-5p的相對表達使用公式2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列表

5.Western blot法檢測：細胞加入蛋白裂解液以裂解細胞，BAC法檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠后行蛋白電泳后將凝膠中蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉3h，分別使用相應的一抗rabbit anti-αB-crystallin(ab13497，1∶800)、anti-ROS (ab5512，1∶900)、anti-SOD (ab83108，1∶900)、anti-c-caspase3(ab214430，1∶600)anti-GAPDH(ab9485，1∶8000)進行孵育，孵育過夜后PBS洗滌3次，每次10min，隨后使用辣根過氧化物酶HRP anti-rabbit IgG(1∶10000)室溫孵育1h。使用ECL化學發(fā)光液進行顯色?；叶戎凳褂肐mage J V1.49軟件進行分析。

6.細胞凋亡率檢測：使用細胞凋亡 ELISA試劑盒(德國Roche Diagnostics公司)。各組細胞轉入96-孔板。使用200μl裂解緩沖液對細胞進行裂解30min。細胞質溶解物轉入雙抗涂抹的細胞板中，加入Anti-DNA-POD和Anti-histone-biotin 孵育2h。使用酶標儀檢測405nm和490nm 波長的吸光度值。

7.熒光素酶報告基因實驗：使用miRNA-target gene預測網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://mirdb.org)預測miR-513b-5p與CRYAB的結合關系。進一步，筆者構建熒光素酶報告質粒對該預測的結合關系進行熒光素酶報告分析。對CRYAB的3′-UTR 區(qū)的mRNA亞克隆進入pmirGLO載體(美國Promega公司)從而構建形成pmirGLO-Luc-CRYAB-3′UTR 野生型報告基因。使用lipofectamine 2000(美國Life Technologies公司)將報告質粒轉入SRA01/04細胞轉染48h。Dual-Glo熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性，使用海腎熒光素酶的活性進行標準化處理。

結 果

1. 白內障患者晶狀體組織中miR-513b-5p 和αB-crystallin的表達變化：檢測晶狀體組織中miR-513b-5p和αB-crystallin的表達變化。首先利用RT-qPCR方法檢測對照組和白內障組中miR-513b-5p 和αB-crystallin的表達變化。與對照組比較，白內障組中miR-513b-5p的水平上調，而αB-crystallin的mRNA水平下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1A、B)；其次利用Western blot法檢測αB-crystallin的蛋白水平變化，結果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，αB-crystallin的蛋白水平下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1C、D)。

圖1 白內障患者晶狀體組織中miR-513b-5p和αB-crystallin的表達A.miR-513b-5p；B.αB-crystallin的mRNA水平相對表達變化；C.αB-crystallin與GAPDH的Western blot法條帶；D.αB-crystallin的蛋白相對表達柱形圖；n=3

2.人晶狀體上皮細胞中過表達miR-513b-5p抑制αB-crystallin的表達：對人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)穩(wěn)定轉染miR-513b-5p的擬似物mimic，即mimic組，該組分別與未添加mimic的陰性對照組(mimic-NC組)和對照組比較發(fā)現(xiàn)，mimic組的miR-513b-5p水平上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A)，mimic-NC與對照組比較，miR-513b-5p的水平變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2A)，成功地過表達了miR-513b-5p。另外對αB-crystallin蛋白水平變化檢測結果發(fā)現(xiàn)，分別與mimic-NC組和對照組比較，mimic組的αB-crystallin的蛋白下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B)，mimic-NC與對照組比較，αB-crystallin的蛋白水平變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2B)。對SRA01/04細胞轉染miR-513b-5p的抑制劑inhibitor(inhibitor組)，24h后發(fā)現(xiàn)inhibitor可以顯著抑制miR-513b-5p的水平(P<0.05，圖2C)。另一組未添加該抑制劑(inhibitor-NC組)。Western blot法檢測αB-crystallin蛋白表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，inhibitor組的αB-crystallin表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2D)；inhibitor-NC組的αB-crystallin表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2D)。

圖2 人晶狀體上皮細胞中調節(jié)miR-513b-5p水平對αB-crystallin表達影響A.miR-513b-5p的相對表達變化；B.αB-crystallin的蛋白水平相對表達變化；C.miR-513b-5p的相對表達變化；D.αB-crystallin的蛋白水平相對表達變化； 與對照組比較，*P<0.05，n=3

3.miR-513b-5p促進人晶狀體上皮細胞氧化應激：使用inhibitor轉染SRA01/04細胞24h，并繼續(xù)對細胞進行400μmol/L H2O2誘導1h(inhibitor+H2O2組)，而inhibitor-NC組也添加400μmol/L H2O2(inhibitor-NC+H2O2組)以作對比。通過Western blot法檢測活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達水平變化來評估SRA01/04細胞的的氧化應激反應。結果發(fā)現(xiàn)，與單獨H2O2組比較，inhibitor+H2O2組中ROS的表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A),而inhibitor-NC+H2O2組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3A)。Western blot法檢測SOD表達水平的結果發(fā)現(xiàn)，與單獨H2O2組比較，inhibitor+H2O2組中SOD的表達水平上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)，而inhibitor-NC+H2O2組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3B)。另外，與對照組比較，mimic組中ROS表達水平上調，且SOD表達水平下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3C)，而與單獨H2O2組比較，mimic組的ROS表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3C)。

4.miR-513b-5p促進人晶狀體上皮細胞的凋亡：通過測定細胞凋亡率和c-caspase3蛋白表達水平考察miR-513b-5p過表達對SRA01/04細胞凋亡的作用。與對照組比較，mimic組的細胞凋亡率和c-caspase3蛋白水平上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3D、E)，而mimic-NC組與對照組比較，細胞凋亡率和c-caspase3蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3D、E)。miR-513b-5p可促進人晶狀體上皮細胞的凋亡。

5.αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因：通過Targetscan及Targets and Expression生物信息學軟件預測，αB-crystallin很有可能是miR-513b-5p的靶基因(圖4A)。為了進一步證實這一預測，采用熒光素酶報告基因實驗驗證miR-513b-5p與αB-crystallin的關系。構建野生型(WT)及突變型(mut)的αB-crystallin(CRYAB) 3′-UTR并克隆到熒光素酶報告基因下游，與對照組比較，miR-513b-5p下調WT- CRYAB的3′-UTR水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4B)。然而與對照組比較，miR-513b-5p對mut-CRYAB的3′-UTR水平無改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4B)，在人晶狀體上皮細胞中CRYAB是miR-513b-5p的下游靶基因。

圖3 miR-513b-5p對晶狀體上皮細胞氧化應激和細胞凋亡的影響A.ROS相對表達變化；B.SOD相對表達變化，n=3;C.ROS相對表達變化；D.細胞凋亡率的相對變化；E.c-caspase3相對表達變化；n=3

圖4 αB-crystallin是miR-513b-5p的功能性靶基因A.CRYAB(αB-crystallin)的3′UTR和miR-513b-5p結合位點；B.熒光素酶報告基因實驗驗證αB-crystallin是miR-513b-5p的下游靶基因； n=3(WT.wild type；mut.mutant type)；C.細胞凋亡率的相對變化；D.ROS相對表達變化；c-CRYAB.CRYAB的過表達質粒，c-null.CRYAB過表達的陰性對照

對SRA01/04細胞轉染mimic基礎上繼續(xù)使用轉染αB-crystallin過表達質粒c-CRYAB(mimic+c-CRYAB組)，檢測細胞氧化應激和凋亡率的變化，驗證αB-crystallin是否為miR-513b-5p的功能性靶基因。與僅添加未修飾質粒的mimic組(mimic+c-null組)比較，mimic+c-CRYAB組的細胞凋亡率下降，而且ROS的表達水平也下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4C)，但是mimic+c-null組與mimic組比較，細胞凋亡率變化和ROS的表達水平變化比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4D)。

討 論

αB-crystallin是一種維持的晶狀體細胞內在穩(wěn)定的關鍵蛋白[11]，因此在白內障等晶狀體疾病中αB-crystallin具有明顯的差異性表達[12]。本研究中，白內障患者晶狀體上皮組織中αB-crystallin的表達明顯下調，而miR-513b-5p的表達水平卻明顯上升。在體外研究中，筆者研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞的氧化應激能力和凋亡率均被高表達miR-513b-5p所上調。通過生信分析方法的預測以及熒光素酶基因報告實驗，確認晶狀體上皮細胞中αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因，其表達受miR-513b-5p的直接調控。進一步發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p可通過對αB-crystallin蛋白質的調節(jié)從而參與調節(jié)晶狀體上皮細胞的氧化應激和凋亡。

miR-513家族成員能調節(jié)多種細胞的凋亡[13, 14]。研究發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p能夠誘導睪丸胚胎癌細胞，而miR-513b可誘導胃癌細胞凋亡，另外miR-513可以調控干擾素γ誘導的人類呼吸道細胞凋亡[10,15,16]。本研究中miR-513b-5p可促進晶狀體上皮細胞中c-caspase3的表達和細胞凋亡率。另外，miR-513b-5p過表達可明顯促進晶狀體上皮細胞的氧化應激標記分子ROS的水平并抑制抗氧化標志物SOD的表達，而且miR-513b-5p抑制劑能夠明顯抑制因H2O2誘導的氧化應激標志物的增加。以上研究表明，miR-513b-5p不僅促進人晶狀體上皮細胞的凋亡，而且可能對晶狀體上皮細胞的氧化應激具有促進作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-513b-5p可直接靶向調控白內障發(fā)展關鍵調控因子αB-crystallin，通過生物信息學分析和熒光素酶報告基因實驗明確了在晶狀體上皮細胞中miR-513b-5p通過miRNA-target機制對αB-crystallin進行直接抑制。以往研究表明，αB-crystallin同樣可作為miR-491的靶基因參與調節(jié)骨肉瘤細胞的肺轉移[9]。而且近年來發(fā)現(xiàn)αB-crystallin參與多種細胞的凋亡和應激過程，在白內障中發(fā)揮關鍵保護作用[6, 17～20]。因此提示miR-513b-5p對于晶狀體上皮細胞的凋亡和氧化應激調節(jié)很可能是通過調控αB-crystallin而發(fā)揮作用。為了明確這一推測，在晶狀體上皮細胞中聯(lián)合過表達miR-513b-5p和αB-crystallin，與單獨過表達miR-513b-5p比較，在誘導的miR-513b-5p調控凋亡和氧化應激分子標志物均被過表達αB-crystallin所抑制。研究表明，miR-513b-5p可通過抑制αB-crystallin促進晶狀體上皮細胞的凋亡和氧化應激。

綜上所述，αB-crystallin是miR-513b-5p的靶基因，其表達受miR-513b-5p的直接調控。而且miR-513b-5p可通過對αB-crystallin蛋白的調節(jié)從而參與調節(jié)晶狀體上皮細胞的氧化應激和凋亡，為白內障機制研究提供了新的思路，為白內障的治療提供新的潛在靶點。