符 晶，孟開順

(海南省三亞市人民醫(yī)院老年病科，海南 三亞 572000)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH )指的是非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，引起神經(jīng)細(xì)胞的血供不足，導(dǎo)致周圍的神經(jīng)組織受到壓迫而引發(fā)代謝及功能障礙[1]。腦出血病情兇險，死亡率高，是高血壓病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,占全部腦卒中的20%～30%[2]。目前ICH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，常見的病因有：微動脈瘤破裂、脂肪玻璃樣變或纖維壞死、腦動脈粥樣硬化以及腦動脈的外膜和中層在結(jié)構(gòu)上薄弱等[3]。法舒地爾是Rho/Roek信號通路的選擇性蛋白激酶抑制劑，Rho/Rho激酶信號通路可以為多種心血管疾病的預(yù)防和治療提供治療靶點(diǎn)。法舒地爾在急性腦缺血中的作用已得到證實[4]，但其對于腦出血腦損傷的影響及相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究探討鹽酸法舒地爾治療腦出血(ICH)大鼠對炎性因子水平、大鼠神經(jīng)功能及認(rèn)知功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康成年Wistar雄性大鼠36只，12周齡，體重250.4±9.0 g，均為SPF級別，喂養(yǎng)于室溫23 ℃～25 ℃、相對濕度45%～60%、光照12 h的環(huán)境中。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組，每組12只。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 首先固定大鼠，將大鼠固定在小動物手術(shù)臺上，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，使用從大鼠頭部順著人字縫皮膚切開大約3～5 cm，露出頭骨。在人字縫右邊1 mm處標(biāo)記，使用穿孔器垂直鉆孔。ICH大鼠模型采用非抗凝自體股動脈血注入右側(cè)尾狀核建立，使用微量進(jìn)樣器沿著小孔注射自體股動脈血50 μL，注射時間維持在5 min內(nèi)，隨后封閉小孔，縫合傷口。對照組只進(jìn)行與模型組相同手術(shù)不注射藥物。

1.2.2 治療方法 術(shù)后3組大鼠同條件飼養(yǎng)，治療組采取腹腔注射鹽酸法舒地爾每天12 mg/kg治療，模型組和對照組均給予等量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。

1.2.3 Morris水迷宮試驗 采用XR-XM101通用型Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)，實驗訓(xùn)練階段連續(xù)進(jìn)行3天，每天訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時，將大鼠面向池壁從四個入水點(diǎn)分別放入水池，對比各組大鼠的Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損評分 大鼠神經(jīng)功能評估應(yīng)用Longa評分標(biāo)準(zhǔn)：正常，無神經(jīng)功能缺損(0分)；左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損(1分)；行走時，大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，中度神經(jīng)功能缺損(2分)；行走時，大鼠向左側(cè)傾倒，中度神經(jīng)功能缺損(3分)；不能自發(fā)行走，存在意識喪失(4分)。

1.2.5 實驗室指標(biāo)檢測 大鼠眼球取血，3500 r/min離心15 min，取上清，使用ELASA法測量血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，所用試劑盒購自上海紀(jì)寧生物，操作按照說明書進(jìn)行。大鼠經(jīng)麻醉處理后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注后斷頭取腦，免疫組化測定腦組織NF-κB表達(dá)，熒光掃描結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的神經(jīng)功能缺損評分

在造模后第1天至第14天，模型組大鼠的Longa評分均顯著的高于對照組(P<0.05)，治療組大鼠的Longa評分顯著的低于模型組(P<0.05)(表1)。圖1為各組大鼠在腦出血后14天的血腫情況，對照組未發(fā)現(xiàn)血腫形成；模型組可見見圖1所示血腫，血腫周圍有較多的炎性細(xì)胞浸潤；治療組可見血腫基本被吸收，膠質(zhì)細(xì)胞增生改變。

表1 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損Longa評分比較 (分)

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(n=12)

圖1 各組大鼠腦組織血腫情況(HE×40)

2.2 大鼠的Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)

在造模后第3天至第14天，模型組大鼠的Morris水迷宮試驗逃避潛伏期高于對照組(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)顯著少于對照組(P<0.05)；治療后，治療組大鼠的Morris水迷宮試驗逃避潛伏期低于模型組(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)高于模型組(P<0.05)；(表2)。

表2 各組大鼠的Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)比較

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(n=12)

2.3 大鼠炎性相關(guān)指標(biāo)

在造模后第3天至第14天，與對照組比較，模型組大鼠的血清IL-6、TNF-α顯著升高(P<0.05)；治療后大鼠血清IL-6、TNF-α降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠炎性相關(guān)指標(biāo)比較 (pg/mL)

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(n=12)

2.4 大鼠腦組織中的NF-κB表達(dá)

在造模后第14天，處死大鼠，取出腦組織，可見模型組中的NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞較多，治療組的NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞顯著減少(圖2)。陽性定量分析見表4，模型組大鼠腦組織中的NF-κB表達(dá)高于對照組(P<0.05)；治療組大鼠腦組織中的NF-κB表達(dá)低于模型組(P<0.05)。

表4 各組大鼠腦組織中的NF-κB表達(dá)相對值比較

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(n=12)

3 討 論

腦出血具有較高的致殘率和死亡率，已經(jīng)成為威脅老年人健康的最重要因素。尋找有效的臨床診治措施十分必要。目前ICH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床中絕大多數(shù)腦出血是因高血壓合并小動脈硬化引起的。研究認(rèn)為，長期的高血壓可導(dǎo)致血管壁纖維素樣壞死或脂質(zhì)透明變性,形成小動脈瘤或夾層動脈瘤[6]。血壓驟然升高時，血管容易破裂，血液進(jìn)入腦組織形成血腫。此外，高血壓會導(dǎo)致遠(yuǎn)端小血管痙攣，引發(fā)出血。腦出血的誘發(fā)因素有很多，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，所以缺乏功效明顯的藥物[7]。因此目前研究探討腦出血的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及研發(fā)高效的藥物具有重要的臨床意義。

圖2 各組大鼠腦組織免疫組化染色(SP 200×)

分子免疫學(xué)和分子生物學(xué)的研究表明[8]，炎性反應(yīng)在腦出血導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損中起著重要作用。因此治療腦出血可以從抑制炎性反應(yīng)、減輕腦水腫、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)方面入手。鹽酸法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥物，為RHO激酶抑制物，具有拮抗炎性因子，保護(hù)神經(jīng)抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。目前多項研究顯示[9-10]，法舒地爾有助于改善腦缺血癥狀及伴隨的神經(jīng)元損傷。但其對于腦出血所致腦損傷的影響及相關(guān)機(jī)制未見報道。本研究觀察法舒地爾在大鼠腦出血性損傷中是否具有保護(hù)作用，以及可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，在造模后第1天至第14天，模型組大鼠的Longa評分均顯著的高于對照組，給予鹽酸法舒地爾治療后的大鼠Longa評分顯著的降低，說明法舒地爾可以降低神經(jīng)缺陷評分，與其他研究結(jié)果相一致[11]。有研究顯示，經(jīng)過法舒地爾治療，慢性低灌注大鼠的認(rèn)知功能損害有所減輕[12]。本研究Morris水迷宮試驗結(jié)果顯示，治療組大鼠在第3天至第14天逃避潛伏期低于模型組，且穿越平臺次數(shù)也增高；結(jié)果表明法舒地爾干預(yù)大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知損害顯著減輕，提示ROCK抑制劑對ICH引起的認(rèn)知功能損害有保護(hù)作用。機(jī)制可能與法舒地爾抑制Rho激酶，減少梗死容積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)[13]。Sanjari等研究發(fā)現(xiàn)[14]，Rho激酶抑制劑可以顯著抑制IL-6、T NF-α的分泌，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路、減少下游炎癥因子有關(guān)。NF-κB 信號通路參與炎癥反應(yīng)，NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子在免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用。研究顯示，ICH后腦內(nèi)NF-B表達(dá)上調(diào)，這可能與ICH的發(fā)病機(jī)制有一定關(guān)系[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的血清IL-6、TNF-α、NF-κB增高，給予法舒地爾治療后大鼠血清IL-6、TNF-α、NF-κB降低；表明鹽酸法舒地爾治療ICH大鼠能降低 IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平，說明舒地爾治療ICH大鼠可以抑制炎性因子釋放，從而減少對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

綜上所述，鹽酸法舒地爾治療ICH大鼠能顯著的改善大鼠神經(jīng)及認(rèn)知功能、降低腦出血后大鼠的炎癥反應(yīng)程度，具有一定的臨床推廣價值，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。