(武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430050)

隨著我國社會經(jīng)濟快速發(fā)展，居民生活水平和醫(yī)療水平的不斷提升，平均壽命明顯增加；統(tǒng)計學(xué)顯示，在2000年我國已進入老齡化社會，2010年我國60歲及以上的老年人口數(shù)已超過1.8億，占總?cè)丝跀?shù)的10.6%，位居世界首位。傳統(tǒng)觀點中口腔正畸治療多適用于12～18歲青少年，在中老年人群中開展較少。但有學(xué)者研究認為，年齡不是決定能否進行口腔正畸的主要因素，人牙周膜細胞成骨化活性起決定性作用?？谇徽委熤性跈C械力刺激下能夠引發(fā)牙周組織改建，最終牙齒移位達到矯治目的。人牙周膜細胞在正畸牙移動過程中發(fā)揮重要的生理介質(zhì)活性，能夠通過細胞增殖和分化反應(yīng)機械力刺激，表達成骨相關(guān)因子。

牙周膜是連接牙齒與牙槽骨的結(jié)締組織，能夠?qū)⒀例X受力傳至牙槽骨，在牙周組織改建中發(fā)揮重要作用[1]。人牙周膜細胞是牙周膜的主要成分，可將機械力信號轉(zhuǎn)化為生物信號[2]。研究者發(fā)現(xiàn)，在牽張應(yīng)力、擠壓應(yīng)力等刺激能夠上調(diào)牙周膜細胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、OCN等成骨相關(guān)基因的表達[3]。Runt相關(guān)基因2是成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)骨形成與骨重建，可通過特有的結(jié)構(gòu)域與下游靶基因結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，上調(diào)成骨細胞表型分化和干細胞向成骨細胞特異性分化[4]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)1/2屬于MAPKs超家族，在細胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。相關(guān)研究顯示，Erk1/2、Runt相關(guān)基因2為力學(xué)信號的靶點[6]，但關(guān)于其在人牙周膜細胞成骨化中的作用仍鮮有研究報道。本研究在體外使用周期性牽張應(yīng)力刺激牙周膜細胞來模擬口腔中牙周膜所受的咬合力，檢測牙周膜細胞中Erk1/2及成骨相關(guān)基因表達情況，探討牽張應(yīng)力刺激下Erk1/2在人牙周膜細胞成骨化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集2018年1月至12月間在本院行口腔正畸治療拔除的健康前磨牙，用于原代培養(yǎng)人牙周膜細胞，患者年齡10～16歲，均簽署知情同意書。主要試劑：胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于北京裕恒豐科技有限公司；ERK1/2通路抑制劑PD98059購于上海翊圣生物科技有限公司；ERK1/2顯性負性突變體構(gòu)建與鑒定由上海捷瑞生物工程有限公司完成；鼠抗人ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體，鼠抗人Runt相關(guān)基因2單克隆抗體購于上海百力格生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜細胞培養(yǎng)與模型構(gòu)建 采用組織塊法和消化法原代培養(yǎng)人牙周膜細胞，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，收集第5代細胞，免疫組化法檢測Vimentin、角蛋白表達，鑒定細胞來源。胰蛋白酶消化第5代細胞，細胞計數(shù)后按1×106/mL接種于FlexcellBioFlex細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24～48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞融合度超過80%時，將培養(yǎng)基中胎牛血清濃度更換為3%，繼續(xù)培養(yǎng)24天。將細胞分為牽張應(yīng)力組、對照組，牽張應(yīng)力組使用FX-5000 T應(yīng)力加載系統(tǒng)分別刺激細胞1、3、6、12、24 h，振幅10%、頻率0.5 Hz，每個循環(huán)中松弛和拉伸時間各1 s；對照組在相同系統(tǒng)中培養(yǎng)，但不給予牽張應(yīng)力刺激。

1.2.2 ERK1/2通路抑制劑PD98059處理 取第5代人牙周膜細胞按1×106/mL接種于6孔板中，分為3組：對照組僅使用含二甲基亞砜的α-MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，不加牽張應(yīng)力；牽張應(yīng)力組使用含二甲基亞砜的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，通過應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h；ERK1/2通路抑制劑組先將PD98059溶于二甲基亞砜，配置100 mmol/L的PD98059儲備液，加入α-MEM培養(yǎng)基中使其終濃度為20 μmol/L，培養(yǎng)1 h后，通過應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h。

1.2.3 ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染 取第5代人牙周膜細胞按1×106/mL接種于6孔板中，分為3組：對照組使用α-MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；空載體轉(zhuǎn)染組、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染組分別取空載體、ERK1/2顯性負性突變體慢病毒原液1 mL，按MOI值比例100加入細胞培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，之后每48 h更換1次培養(yǎng)基，7天后共聚焦顯微鏡下觀察人牙周膜細胞轉(zhuǎn)染情況。將轉(zhuǎn)染成功后的空載體轉(zhuǎn)染組、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染組再各分2個亞組：牽張應(yīng)力組(應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激細胞3 h)、靜止組(不加牽張應(yīng)力)。

1.2.4 RT-PCR檢測 Trizol法提取人牙周膜細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN、β-actin引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。Runt相關(guān)基因2上游5′-AATTATCGCACGACGGTAAGC-3′，下游5′-ACCTACTTAGAC AAACCGCTG-3′；ALP上游5′-TCGCGGACCCAGA GAAGTGAT-3′，下游5′-AGC CGAAAGTCCTCCGGATA-3′；OCN上游5′-AAGACGTAACCGAGGTCACT G-3′，下游5′-TGTTGGAGAGGTTTA CCACCC-3′；內(nèi)參β-actin上游5′-TGAGGCTGGA AGTGGAAGG-3′，下游5′-TTAGGGTAGTGGTAGAAGGT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s。擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測 人牙周膜細胞中加入RIPA裂解液，3 000 r/min離心20 min，收集上清BCA蛋白定量，目標蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加鼠抗人ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人Runt相關(guān)基因2單克隆抗體(1∶1 000)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，滴加HRP標記的鼠抗人IgG(1∶2 000)，室溫靜置2 h，ECL顯色，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究使用SPSS20.0處理，研究資料以均數(shù)±標準差表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人牙周膜細胞鑒定

傳代培養(yǎng)的人牙周膜細胞呈紡錘形或梭形，細胞核呈規(guī)則的卵圓形，具有成纖維細胞結(jié)構(gòu)特點。免疫組化染色顯示(圖1)，人牙周膜細胞中可見Vimentin陽性表達，角蛋白陰性表達，提示獲取的細胞源自發(fā)育早期的中胚層。

圖1 免疫組化檢測人牙周膜細胞Vimentin和角蛋白表達A：傳代培養(yǎng)的人牙周膜細胞(100×)；B：Vimentin陽性表達(SP 200×)；C：角蛋白陰性表達(SP 200×)

2.2 牽張應(yīng)力刺激不同時間時各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達

牽張應(yīng)力刺激不同時間p-ERK1/2蛋白表達水平均明顯提升(P<0.05)，其中以刺激1、3 h時p-ERK1/2蛋白表達水平最高；ERK1/2蛋白表達水平在牽張應(yīng)力刺激不同時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；牽張應(yīng)力刺激3、6 h時Runt相關(guān)基因2蛋白表達水平明顯提升(P<0.05)，12 h時Runt相關(guān)基因2蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。提示牽張應(yīng)力刺激可激活人牙周膜細胞中的ERK1/2信號通路。見表1，圖2。

表1 牽張應(yīng)力刺激不同時間ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達

與0 h比較，aP<0.05(n=6)

圖2 ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達變化

2.3 ERK1/2通路抑制劑干預(yù)對人牙周膜細胞成骨分化相關(guān)基因表達的影響

牽張應(yīng)力組Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量明顯高于ERK1/2通路抑制劑組、對照組(P<0.05)；Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量在ERK1/2通路抑制劑組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；見表2。

表2 三組人牙周膜細胞中Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量比較

與對照組比較，aP<0.05；與牽張應(yīng)力組比較，bP<0.05(n=6)

2.4 ERK1/2通路抑制劑干預(yù)對ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達的影響

牽張應(yīng)力組p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白相對表達量明顯高于ERK1/2通路抑制劑組與對照組(P<0.05)；ERK1/2蛋白表達水平在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖3。

表3 人牙周膜細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白相對表達量比較

與對照組比較，aP<0.05；與牽張應(yīng)力組比較，bP<0.05(n=6)

圖3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達的Western blot電泳圖1：對照組；2：牽張應(yīng)力組；3：ERK1/2通路抑制劑

2.5 牽張應(yīng)力刺激對人牙周膜細胞成骨分化相關(guān)基因表達的影響

空載體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組(P<0.05)；Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量在空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；見表4。

表4 人牙周膜細胞中Runt相關(guān)基因2、ALP、OCN mRNA相對表達量比較

與空載體轉(zhuǎn)染靜止組比較，aP<0.05；與突變體轉(zhuǎn)染靜止組比較，bP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組比較，cP<0.05(n=6)

2.6 牽張應(yīng)力刺激對ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達的影響

空載體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白相對表達量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染靜止組、突變體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組(P<0.05)；ERK1/2蛋白表達水平在4組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖4。

表5 人牙周膜細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白相對表達量比較

與空載體轉(zhuǎn)染靜止組比較，aP<0.05；與突變體轉(zhuǎn)染靜止組比較，bP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組比較，cP<0.05(n=6)

圖4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、Runt相關(guān)基因2蛋白表達變化1：空載體轉(zhuǎn)染靜止組；2：突變體轉(zhuǎn)染靜止組；3：空載體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組；4：突變體轉(zhuǎn)染牽張應(yīng)力組

3 討 論

機械力刺激在牙周組織改建中發(fā)揮重要作用[7]。人牙周膜細胞具有成骨細胞表型特征，在一定條件下具有誘導(dǎo)礦化能力，能夠形成礦化小結(jié)和礦化的胞外基質(zhì)[8]。人牙周膜細胞是牙周膜的重要組成成分，可將外界機械力刺激信號轉(zhuǎn)化為生物信號[9-10]。機械力刺激信號傳導(dǎo)是目前研究熱點之一，細胞感受力學(xué)信號主要通過以下途徑：①細胞膜表面蛋白質(zhì)在機械力刺激信號的作用下，空間構(gòu)象發(fā)生改變，位于細胞膜表面的鈣離子通道、黏附蛋白等被激活，出現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，向下游逐級傳遞信號[11]；②細胞骨架受機械力刺激信號的影響發(fā)生改變，導(dǎo)骨架中的張力重新分布，促使機械力信號向化學(xué)信號的轉(zhuǎn)變[12]。目前研究認為，細胞種類與機械力刺激類型是細胞內(nèi)傳遞力學(xué)信號方式的主要決定因素。

絲裂原活化蛋白激酶是分布于細胞質(zhì)中，具有絲氨酸、酪氨酸磷酸化活性[13-14]。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶的主要成員，在機械力刺激信號的傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[15]。相關(guān)研究顯示，機械力刺激信號可經(jīng)鈣離子通道與整聯(lián)蛋白途徑活化ERK1/2信號通路，促進成骨細胞分化[16-17]。本研究顯示，牽張應(yīng)力組p-ERK1/2蛋白表達水平明顯高于對照組，以應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激1、3 h時最為明顯；提示人牙周膜細胞在牽張應(yīng)力刺激下ERK1/2信號通路被激活。

為進一步探討ERK1/2表達對人牙周膜細胞成骨分化的影響，本研究分別使用ERK1/2通路抑制劑PD98059、ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染來抑制ERK1/2信號通路活化。結(jié)果顯示，牽張應(yīng)力組成骨細胞表型基因ALP、OCN mRNA表達水平明顯高于對照組，提示機械力刺激能夠繼發(fā)人牙周膜細胞成骨分化的潛力。使用PD98059阻斷后，ALP、OCN mRNA表達水平明顯下調(diào)；且ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染也明顯阻斷了ALP、OCN mRNA表達在牽張應(yīng)力刺激下的升高；提示ERK1/2信號通路活化介導(dǎo)了牽張應(yīng)力刺激下人牙周膜細胞的成骨分化。Runt相關(guān)基因2是骨發(fā)育和改建的主要調(diào)節(jié)基因，在間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化中發(fā)揮重要作用，且能夠抑制充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化[18-20]。研究者發(fā)現(xiàn)，具有成骨樣特征的人牙周膜細胞中Runt相關(guān)基因2是機械力刺激信號的靶蛋白，當(dāng)受到機械力刺激時可上調(diào)Runt相關(guān)基因2的表達[21]。本研究顯示，Runt相關(guān)基因2表達水平在應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激1 h時即出現(xiàn)升高，在刺激3 h時達到峰值。給予PD98059阻斷劑和ERK1/2顯性負性突變體轉(zhuǎn)染后，Runt相關(guān)基因2表達水平明顯下降，提示ERK1/2信號通路參與了Runt相關(guān)基因2的調(diào)控過程。

綜上所述，在應(yīng)力加載系統(tǒng)刺激下，人牙周膜細胞的成骨分化過程中可通過激活ERK1/2信號通路，上調(diào)Runt相關(guān)基因2表達，同時促使Runt相關(guān)基因2與成骨基因ALP、OCN上的啟動子集合，激活轉(zhuǎn)錄過程。但本實驗是在體外使用周期性牽張應(yīng)力刺激牙周膜細胞來模擬口腔中牙周膜所受的咬合力，易受到牽張力強度、溫度等多種因素的影響，在今后的研究中應(yīng)進一步排除外界干擾因素進行深入研究。