(1.如皋市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 如皋226500；2.南通市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南通226000； 3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南通 226000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種預(yù)后較差的血管疾病[1]。高肺血流肺動脈高壓是先天性心臟病最常見的并發(fā)癥，又稱為先心病肺動脈高壓，表現(xiàn)為肺血管床結(jié)構(gòu)和/或功能改變，導(dǎo)致肺血管阻力和肺動脈壓力進(jìn)行性增高[2]。高肺血流肺動脈高壓會導(dǎo)致右室擴(kuò)張，引起心力衰竭，甚至患者死亡[3]。對于NO信號通路的干預(yù)已被用于肺動脈高壓的治療，持續(xù)吸入NO是目前肺動脈高壓的重要治療方法。亞硝酸鹽(nitrite)以前被認(rèn)為是NO的一種無活性代謝產(chǎn)物。隨著研究進(jìn)展，越來越多的學(xué)者認(rèn)為亞硝酸鹽具有重要的生理及病理生理功能[4]。本研究探討亞硝酸鈉(NaNO2)治療高肺血流肺動脈高壓大鼠的效果及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取SPF級成年SD雄性大鼠36只，體重(215.4±9.0)g，喂養(yǎng)于室溫23 ℃～25 ℃、相對濕度45%～60%、光照12h的環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

食品級亞硝酸鈉(批號：20121013)，購自上?？撇?xì)化學(xué)品公司；一氧化氮試劑盒(酶法)，購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠NF-κB抗體購自美國Abcam公司；兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠VEGF抗體購自美國Biowofld公司，驢抗兔IgG工作液購自上海滬峰化工有限公司；總蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建模 選取清潔級成年SD雄性大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組，每組各12只，模型組和治療組參照文獻(xiàn)方法建立大鼠高肺血流肺動脈高壓模型[5]，對照組僅采取假手術(shù)。具體方法如下：實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食12h，使用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，大鼠仰臥固定于鼠板上。大鼠腹部旁正中切口，打開腹腔，暴露腹主動脈和下腔靜脈。采用腹主動脈-下腔靜脈分流手術(shù)建立高肺血流肺動脈高壓大鼠模型，在該段腹主動脈中下1/3處，使用靜脈穿刺針穿入腹主動脈以及腹主動脈-下腔靜脈聯(lián)合壁，形成瘺口。使用粘合劑封住穿刺口。分流模型建立成功后，復(fù)位腹腔內(nèi)臟器，關(guān)閉腹腔。

1.3.2 干預(yù)方法 治療組給予NaNO23mg/kg灌胃，1次/天，連續(xù)3周。模型組和對照組僅給予等量生理鹽水灌胃，末次給藥結(jié)束24 h后進(jìn)行以下指標(biāo)檢測。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 大鼠肺動脈HE染色 取大鼠右肺上2葉肺組織，給生理鹽水及4%多聚甲醛灌注固定。經(jīng)石蠟包埋，切片做HE染色。

1.4.2 血流動力學(xué)指標(biāo)測定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，固定于小動物手術(shù)臺上。經(jīng)頸正中切口行氣管切開，接TKR-200C型小動物呼吸機(jī)(江西特力麻醉呼吸機(jī)設(shè)備公司)，潮氣量2 mL/100 g、呼吸頻率40次/min。暴露左頸總動脈，連接壓力傳感器及PM-9000多導(dǎo)生理記錄儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，穩(wěn)定后記錄平均肺動脈壓力(MPAP)、平均右心室內(nèi)壓(MRVP)、右室收縮壓(RVSP)。記錄完畢后，處死大鼠，采集肺動脈血樣3～4 mL，4 ℃下以3000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存待測；取出大鼠心臟，用小手術(shù)剪剪去心房組織，分離右心室、室間隔+左心室。沖洗，吸干水分，稱重。計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index, RVHI)。公式如下：右心室質(zhì)量/(左心室+室間隔)質(zhì)量=右心室肥厚指數(shù)。

1.4.3 血清及肺勻漿組織中NO含量測定 血流動力學(xué)指標(biāo)記錄完畢后，處死大鼠，采集肺動脈血樣3～4 mL，4 ℃下以3000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存待測；稱取右肺上葉肺組織，制備10%肺勻漿。根據(jù)一氧化氮試劑盒(酶法)的說明書測定血清及肺勻漿組織中NO水平。

1.4.4 肺組織中的NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)測定 免疫組化方法檢測肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta，TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子((vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)。將切片置入二甲苯中脫蠟(10 min×3次)、梯度乙醇水化處理(10 min×3次)，S-P法檢測，使用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫留置15分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。3%牛血清清蛋白封閉1h處理，然后分別滴加1∶100兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠VEGF抗體，4℃過夜。PBS沖洗3次每次3分鐘，滴加生物素標(biāo)記的驢抗兔IgG工作液(上海滬峰化工有限公司)，室溫孵育1 h。PBS沖洗3次每次3分鐘，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，孵育1h。新鮮配制DAB溶液，顯色處理，自來水沖洗。蘇木素復(fù)染，自來水沖洗。切片經(jīng)過梯度酒精干燥，二甲苯透明，之后使用中性樹膠封固。脫色后，在顯微鏡下觀察處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺動脈病理學(xué)形態(tài)觀察

在HE染色后，光鏡下觀察，對照組大鼠肺動脈壁薄且光滑、內(nèi)皮細(xì)胞外形扁平；肺動脈高壓組大鼠肺動脈內(nèi)膜及中膜顯著肥厚，平滑肌細(xì)胞較對照組明顯增多且排列比較紊亂，肺動脈的管腔變的較為狹窄，可見較多的炎性細(xì)胞浸潤；治療組的上述情況較模型組均有顯著的改善(圖1)。

圖1 各組大鼠肺動脈重構(gòu)結(jié)果(HE 400×)

2.2 各組大鼠的血流動力學(xué)指標(biāo)

干預(yù)3周后，模型組大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI測定值均高于對照組(P<0.05)；治療組大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI測定值均低于模型組(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠的血流動力學(xué)指標(biāo)比較

與對照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

2.3 各組大鼠的血清及肺勻漿液中的NO水平

干預(yù)3周后，模型組大鼠的血清NO測定值低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠血清NO測定值高于模型組(P<0.05)；對照組、模型組和治療組肺組織勻漿液中NO含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 大鼠的血清及肺勻漿液中的NO含量比較

與對照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05(n=12)

2.4 各組大鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)

干預(yù)3周后，模型組大鼠肺組織中NF-κB蛋白，TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.05)；治療組肺組織中NF-κB蛋白、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)，其蛋白表達(dá)見圖2，相對表達(dá)量見表3。

圖2 大鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)

組別NF-κBTGF-β1VEGF對照組0.5±0.10.42±0.10.6±0.2模型組1.1±0.4a1.69±0.4a1.2±0.4a治療組0.8±0.3ab0.8±0.3ab0.8±0.2abF43.06529.87531.164P0.0000.0000.000

與對照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05(n=12)

3 討 論

肺動脈高壓是指肺動脈壓力升高超過一定界值并導(dǎo)致右心室衰竭為特征的一種疾病[6]。先天性心臟缺陷引起的肺動脈高壓是兒童先天性心臟病最常見并發(fā)癥之一。肺小動脈進(jìn)行性狹窄導(dǎo)致肺動脈持續(xù)增高，右心壓力負(fù)荷過重、右心衰竭。肺小動脈血管重構(gòu)是肺動脈高壓最基本的病理特征，先天性心臟病引起肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面。多數(shù)研究表明，肺動脈高壓的發(fā)展與血管舒張因子和血管收縮因子的失衡有關(guān)[7-8]。NO吸入作為一種選擇性的肺血管擴(kuò)張劑，是目前肺動脈高壓的重要治療方法。但是，NO吸入治療設(shè)備昂貴，NO作用時(shí)間較短，儀器操作相對復(fù)雜，因此在臨床的應(yīng)用受到一定限制。

亞硝酸鹽是一種無機(jī)陰離子，以往研究認(rèn)為亞硝酸鹽是NO的一種無活性代謝產(chǎn)物。目前有研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽會通過某些途徑重新被機(jī)體利用還原成NO[9]。NO是以氧依賴的L-精氨酸作為底物，一氧化氮合酶(NOS)催化下產(chǎn)生。Sitbon等研究顯示，當(dāng)機(jī)體的NOS-NO途徑無法正常產(chǎn)生NO時(shí)，NO不通過經(jīng)典的NO途徑生成，而由亞硝酸鹽還原產(chǎn)生[10]。研究顯示，亞硝酸鹽具有一定的血管擴(kuò)張效應(yīng)，能導(dǎo)致血管舒張，降低血壓[11]。袁瑞雪等研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的肺動脈高壓模型中，亞硝酸鹽有肺血管擴(kuò)張和產(chǎn)生血管重塑的治療作用[12]。本研究結(jié)果顯示，通過在腹主動脈和下腔靜脈之間進(jìn)行造瘺手術(shù)，能成功建立高肺血流肺動脈高壓大鼠模型，給予NaNO2干預(yù)3周后，治療組大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI測定值均顯著降低，表明NaNO2對高肺血流肺動脈高壓大鼠具有顯著的降壓效果，并能減輕肺動脈血管和右心臟重構(gòu)，與Jain等之前報(bào)道的結(jié)果相一致[13]。另外，NaNO2干預(yù)3周后，治療組大鼠血清NO測定值均顯著的高于模型組，表明肺動脈高壓大鼠MPAP降低與亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO產(chǎn)生血管擴(kuò)張作用有關(guān)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌特定的生長因子如VEGF、TGF-β等[14]，其分泌紊亂可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞能紊亂、增殖和凋亡失衡，直接促進(jìn)肺小動脈血管重構(gòu)。NF-κB是一種調(diào)節(jié)各種生物現(xiàn)象的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)TGF-β1、VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管重構(gòu)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)3周后，治療組肺組織中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)顯著低于模型組，說明NaNO2可以降低NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的活性有一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述，NaNO2對高肺血流肺動脈高壓大鼠具有顯著的降低肺動脈高壓效果，減輕肺動脈血管和右心臟重構(gòu)、其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肺組織中NF-κB、TGF-β1、VEGF及NO水平有關(guān)，值得在臨床進(jìn)一步探討。