周志云，由亞寧 ，馬鵬飛，吳 晗，趙 冉

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061； 2.西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，陜西 西安 710061；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

蜂蜜是天然的防腐劑、黏合劑［1-3］，具有較高營養(yǎng)價(jià)值和功效［4-5］。明代李時(shí)珍《本草綱目》云：“蜂蜜，其入藥之功有五：清熱也，補(bǔ)中也，解毒也，潤燥也，止痛也”［6］。其作為中藥輔料使用在我國歷史悠久。本研究中參照2015年版《中國藥典（四部）》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法［7-8］，用5種微生物代表菌株，加入不同含糖濃度的蜂蜜中，采用平皿法試驗(yàn)，確定其抑菌性與含糖濃度的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HFsafe-1200 LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BS2202S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（天津鑫博得儀器有限公司）；LRH-250B型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；VITEK2型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國梅里埃有限公司）；CH型三目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］和黑曲霉［CMCC（F）98003］均源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第2代。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)為170325），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)為170316），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)為170329），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號(hào)為160316），均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 供試品

槐花蜜（批號(hào)為20171108，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司）；棗花蜜（批號(hào)為20171206，玻璃瓶裝，陜西秦嶺蜂業(yè)有限公司）；秦嶺紫椴雪蜜（批號(hào)為20180428，玻璃瓶裝，陜西春秋食品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)菌種鑒定

按照VITEK2型全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)操作規(guī)范，將5種試驗(yàn)菌株分別進(jìn)行增菌、分離、純化，并進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。以無菌方式挑取分純菌落置3 mL 0.45%NaCl試管中，采用比濁儀調(diào)整菌液濃度至規(guī)定菌懸液濃度。根據(jù)各個(gè)菌株革蘭染色結(jié)果選定相應(yīng)鑒定卡片，按順序放在載卡架上，輸樣管插入菌液管中。將載卡架放入儀器的填充倉，關(guān)閉倉門，進(jìn)行鑒定培養(yǎng)。結(jié)果顯示，均檢出標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.2 試驗(yàn)菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB中，35℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于SDB中，25℃培養(yǎng)3 d；將黑曲霉接種于SDA中，25℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。采用10倍稀釋法將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉分別稀釋至含菌量為104cfu／mL的試驗(yàn)菌液。

2.3 培養(yǎng)基適用性檢查

取不大于100 cfu的標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，分別接入測(cè)試與對(duì)照培養(yǎng)基，經(jīng)規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)試結(jié)果與對(duì)照培養(yǎng)基平均菌落數(shù)的比值應(yīng)為0.5～2.0，且菌落形態(tài)、大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌生長良好。培養(yǎng)基適用性檢查符合2015年版《中國藥典（四部）》附錄檢查方法。

2.4 平皿法驗(yàn)證試驗(yàn)

供試液制備：取3個(gè)品種的蜂蜜（槐花蜜、棗花蜜、椴樹蜜）各 15，25，40，55，70，80mL，分別加 TSB 至 100mL。45℃恒溫振搖15 min使其溶解均勻，制成6種含糖濃度分別為 11.25%，18.75%，30.00%，41.25%，52.50%，60.00%的供試液。

試驗(yàn)組溶液制備：取3個(gè)品種蜂蜜的6種不同含糖濃度的供試液，各分裝于5個(gè)無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，再分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌液各0.1 mL。

菌液對(duì)照組制備：將TSB分裝于5個(gè)無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗(yàn)組操作，分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液各0.1 mL。

供試品對(duì)照組制備：取供試液9.9 mL，加入TSB 0.1 mL。

回收率試驗(yàn)：分別取上述試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組和供試品對(duì)照組溶液各1 mL，置直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，注入TSA或SDA，混勻，凝固，TSA平板在35℃培養(yǎng)3 d，SDA平板在25℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。供試品5種試驗(yàn)菌的回收率均需進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，若供試品5種試驗(yàn)菌的回收率均為0.5～2.0，供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)通過。供試品回收率（%）＝（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）／菌液對(duì)照組菌落數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

表1 霉菌和酵母菌總數(shù)回收率平皿法測(cè)定結(jié)果

2.5 回收率曲線圖

需氧菌總數(shù)回收率詳見圖1，霉菌、酵母菌總數(shù)回收率詳見圖2。可見，3種不同蜂蜜隨著含糖濃度（含糖分?jǐn)?shù)）的升高對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均有不同程度的抑制作用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度大于40%時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌回收率試驗(yàn)呈顯著下降趨勢(shì)。而棗花蜜在含糖濃度30%以上時(shí)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的回收率便呈下降趨勢(shì)。3種蜂蜜對(duì)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用不明顯，均為 0.5～2.0，符合 2015 年版《中國藥典》要求。3種不同蜂蜜對(duì)白色念珠菌有較明顯的抑制作用，槐花蜜和椴樹蜜在含糖濃度40%以上時(shí)回收率呈下降趨勢(shì)，棗花蜜在含糖濃度30%以上時(shí)回收率呈下降趨勢(shì)。3種蜂蜜對(duì)黑曲霉的抑制作用不明顯，均為0.5～2.0。與需氧菌總數(shù)回收率試驗(yàn)中的白色念珠菌與黑曲霉的回收率測(cè)定結(jié)果一致。

表2 需氧菌總數(shù)回收率平皿法測(cè)定結(jié)果

圖2 霉菌、酵母菌總數(shù)回收率曲線圖

3 討論

采用平皿法對(duì)6個(gè)不同含糖濃度的3種蜂蜜進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)回收率測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果說明，隨著蜂蜜含糖濃度（含糖分?jǐn)?shù)）的增加，各組試驗(yàn)菌回收率均呈降低趨勢(shì)。含糖濃度高的蜂蜜對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、酵母菌均有較強(qiáng)抑制作用，而對(duì)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用相對(duì)較弱。

本研究中的蜂蜜是一種飽和甚至過飽和糖溶液［9-10］，具有很高的滲透特性（吸水性）［11］。在高滲性環(huán)境下，足以使微生物等細(xì)菌大量脫水死亡，因此蜂蜜的高含糖濃度直接影響微生物生長［12］。蜂蜜是天然的防腐劑，在中成藥及大、小蜜丸等添加蜂蜜制劑的藥品生產(chǎn)中，因無具體用量及濃度標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，有可能存在使用蜂蜜用量過度等情況，導(dǎo)致被輕度污染的微生物受到高糖濃度蜂蜜抑制，使藥品微生物檢驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對(duì)藥品質(zhì)量的判定帶來影響。

2015年版《中國藥典》對(duì)輔料蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)未明確規(guī)定，建議研究制訂輔料蜂蜜及相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，以更好地規(guī)范制藥行業(yè)的生產(chǎn)行為，確保藥品質(zhì)量安全。