李畏嫻 ，張愛麗 ，錢子剛 ，陳 潔 ，孫 輝 ，陳永剛 ，劉 幸 △

（1.云南省昆明市第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650041；2.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500）

金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu是石竹科單種屬植物［1］，主要藥理作用為鎮(zhèn)痛、抗炎、抗類風濕、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗氧化等。目前對金鐵鎖的研究主要集中在根部，其主要化學成分是三萜皂苷和環(huán)肽類化合物［2］，皂苷的母核結(jié)構(gòu)為齊墩果烷型。近年來，對金鐵鎖化學成分的研究主要為三萜皂苷，較為集中的是齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物，目前皂苷類成分被認為是主要活性成分之一［3］。金鐵鎖收錄入《中國植物紅皮書》中，屬國家二級保護植物［4］。目前，由于人工栽培技術(shù)還不完善，金鐵鎖藥材主要通過野生采挖，對野生植物資源造成嚴重破壞，且由于其自然分布區(qū)域狹窄且生長環(huán)境極其惡劣，導致自然分布資源迅速減少。通過化學合成或半化學合成其有效成分在一定程度上能降低成本，提高合成效率，但毒性大，工藝流程復雜，環(huán)境污染嚴重?；诤铣缮飳W方法在微生物體內(nèi)重建金鐵鎖三萜皂苷的生成途徑，實現(xiàn)金鐵鎖藥用有效成分生物合成途徑解析，并在此基礎(chǔ)上通過研究生物合成途徑和關(guān)鍵酶基因的挖掘鑒定與調(diào)控，通過金鐵鎖三萜皂苷人工細胞工廠開發(fā)直接發(fā)酵法生產(chǎn)金鐵鎖藥用有效成分。

1 有效成分

1.1 萜類化合物

萜類化合物又稱類異戊二烯，廣泛存在于植物界的一類天然烴類化合物，基本組成骨架為異戊二烯單元，分子式為（C5H8）n。根據(jù)所含異戊二烯數(shù)目分為單萜、倍半萜、雙萜、三萜、四萜、多萜等。次生代謝萜類化合物通常用作食品添加劑、農(nóng)藥和藥物等，具有重要的經(jīng)濟價值［5］。由黃花蒿中提取到了青蒿素，是治療瘧疾的強有效藥［6］。在臨床，中藥中所含有的萜類化合物為重要有效成分。近年的研究表明，樺木酸及其衍生物具有較多生物活性，對多種腫瘤細胞有較強毒殺效應而對正常細胞無殺傷力［7］。萜類生物合成途徑是生物體內(nèi)主要的代謝途徑，隨著萜類化合物的發(fā)現(xiàn)及其在生活、生產(chǎn)中的應用，其生物合成途徑的研究也受到極大關(guān)注。

1.2 三萜類化合物

三萜類化合物是由6個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元聯(lián)結(jié)而成，多數(shù)含30個C原子，大多數(shù)三萜皂苷元以五環(huán)三萜形式存在。五環(huán)三萜皂苷元的碳架主要有齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型［8］等。三萜類化合物是中草藥中的重要有效成分，其生物合成途徑為甲羥戊酸途徑（MVA）。目前，對五環(huán)三萜化合物的研究主要集中在齊墩果酸。

1.3 三萜皂苷的合成生物學

齊墩果烷廣泛存在三萜植物中，主要以苷的形式存在，但亦有以游離狀態(tài)形式存在。其中分布較廣的皂苷元為齊墩果酸，存在于中藥女貞子和青葉膽全草中，具有降轉(zhuǎn)氨酶作用，是治療肝炎的有效藥物［9］。大部分植物中都有五環(huán)三萜皂苷，在植物中最主要的功能是防御病原體和害蟲；在人體中可增強藥用植物有效成分的產(chǎn)生，提高藥用價值。齊墩果烷類三萜化合物具有抗癌、抗病毒、抗氧化及保肝等作用，如齊墩果酸作為齊墩果烷型五環(huán)三萜的標志性化合物，具有抗炎［10］、抗腫瘤［11］、抗變態(tài)反應、促進肝細胞再生［12］和促進肝糖原合成［13］的重要生理活性，但自然界中每個植物所含齊墩果酸的含量均較低，目前的來源主要是通過從植物中提取和化學合成的方法來獲得，非常不利于環(huán)境和資源的可持續(xù)發(fā)展，利用合成生物學的原理和方法，可實現(xiàn)藥用資源的可持續(xù)利用。

2 生物合成途徑

2.1 MVA途徑

三萜皂苷生物合成途徑主要是分為前體形成、骨架構(gòu)建、后期修飾三部分（見圖1）。碳源經(jīng)過MVA途徑合成萜類基本前體，再由萜類合成酶催化合成三萜類骨架后，再由CYP450酶及UGT酶對骨架的結(jié)構(gòu)進行修飾，最終獲得相關(guān)的三萜類皂苷化合物。有學者將2，3-環(huán)氧角鯊烯作為三萜皂苷生物合成途徑上游和下游途徑的分支點，三萜皂苷的后期修飾酶在其生物合成途徑中作為關(guān)鍵酶基因，是產(chǎn)生萜類次生代謝最終產(chǎn)物的關(guān)鍵。

2.2 關(guān)鍵酶基因

前期研究中，已成功地在釀酒酵母中完成MVA途徑的優(yōu)化，在參與三萜皂苷生物合成下游途徑的關(guān)鍵元件中，參與植物體內(nèi)多種生命活動獲得參與三萜皂苷生物合成細胞色素CYP450單加氧酶為關(guān)鍵酶基因。植物細胞中，CYP450為催化初級和次級代謝反應作用的催化劑，可參與各類化合物的合成與代謝反應［14-15］。CYP450是在環(huán)氧角鯊烯合成不同構(gòu)型的母核后進行一系列的結(jié)構(gòu)修飾，包括羥基化、醛基化、酮基化、羧基化和脫氧脫水等氧化反應［16］。CYP450參與催化合成多種具有藥用價值的次生代謝產(chǎn)物，如皂苷［17-18］、青蒿素［19-20］、紫杉酚［21］、黃酮類化合物［22］、莨菪堿［23］等。

研究至今，大豆來源的GmCYP93E1基因是最早被證實具有催化合成三萜化合物的CYP450，其催化合成齊墩果 -12- 烯 3，24- 二醇［17］。甘草中的 CYP88D6 和CYP72A154基因可催化甘草次酸的合成，并參與甘草酸苷的生物合成［24-25］。葡萄來源的 VvCYP716A15和VvCYP716A17在生物合成途徑中，催化β-香樹脂生成齊墩果酸，又催化羽扇豆醇合成燁木酸［26］。來源于蒺藜狀苜蓿的基因MtCYP716A12在生物合成途徑中的作用是催化齊墩果酸的合成［18，26］。從人參中克隆到的基因PgCYP716A4，PgCYP716A52v2，PgCYP716A53v2 參與人參皂苷合成途徑［27-29］，在生物合成過程中，人參來源的CYP450基因依次發(fā)揮自己的催化作用，PgCYP716A47可以催化達瑪烯二醇合成原人參二醇，PgCYP716A53v2催化原人參二醇合成原人參三醇，PgCYP716A52v2催化合成齊墩果酸型皂苷（見圖2）。

3 合成生物學

3.1 常用菌株

在合成生物學的運用過程中，有較多的微生物可作為度盤菌株的使用，如完成全基因測序的釀酒酵母，遺傳背景清晰的大腸桿菌、鏈霉菌，能產(chǎn)阿維菌素的阿維鏈霉菌、天藍鏈霉菌、惡臭假單胞菌等一系列的微生物。

3.2 底盤菌株選用-釀酒酵母

釀酒酵母具有遺傳背景清楚，發(fā)酵密度大，生物安全性好，遺傳改造和發(fā)酵方法成熟等優(yōu)點，因此在工業(yè)生產(chǎn)中常選擇為底盤菌株的微生物，在基因工程、遺傳學分析及蛋白表達研究領(lǐng)域被廣泛應用［30-31］，因安全、無毒、不致病等優(yōu)點被廣泛應用于食品與醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域。1996年已完成了對釀酒酵母的全基因組測序工作［32］。在釀酒酵母中開展了酵母基因敲除技術(shù)、酵母基因定位技術(shù)、酵母功能基因芯片技術(shù)等［33］。利用釀酒酵母可以很大程度地闡明高等真核生物基因表達調(diào)控的基本原理及基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系，從而起到表達鑒定或異源表達目的蛋白的作用［34-35］，建立了酵母表達系統(tǒng)。

圖2 參與三萜合成的CYP450s

釀酒酵母體內(nèi)自身含有提供萜類化合物合成的MVA途徑，能代謝合成以麥角甾醇為主要產(chǎn)物的固醇類物質(zhì)［36］，能用來生產(chǎn)高修飾型外源天然產(chǎn)物如β-香樹脂［37-38］，因而廣泛用于構(gòu)建生產(chǎn)天然產(chǎn)物的底盤工程菌株［39］。目前，構(gòu)建釀酒酵母基因工程菌，建立細胞工廠高產(chǎn)所需有效成分已成為研究主流，而且已有很多成功構(gòu)建天然產(chǎn)物細胞工廠的實例，如Keasling團隊利用合成生物學的方法在酵母中合成青蒿素的前體物青蒿酸，產(chǎn)量可達 25 g ／L［20］。目前，釀酒酵母菌在青蒿酸生物合成路線比較清晰的基礎(chǔ)上，采用一系列的基因調(diào)控方法，通過酵母代謝工程菌合成了青蒿酸，其產(chǎn)量超過100 mg／L，實現(xiàn)了在酵母中大量合成抗瘧藥物青蒿素的前體物質(zhì)［20］。DAI 等［40-41］已在釀酒酵母底盤細胞成功構(gòu)建了原人參二醇的生物合成途徑。構(gòu)建釀酒酵母工程菌株，能快速高產(chǎn)藥用有效成分或其中間體［19］，為瀕危藥材的保護和可持續(xù)利用提供應用基礎(chǔ)。HAN等［28］利用釀酒酵母成功構(gòu)建了人參中原人參二醇合成酶基因CYP716A47的異源表達鑒定菌株，完成了人參中的達瑪烯二醇合成酶基因PgDDS與原人參二醇合成酶基因CYP716A47的異源共表達，實現(xiàn)了利用釀酒酵母培養(yǎng)體系自身所含底物產(chǎn)目標化合物?？梢姡劸平湍笧槿圃碥盏漠愒创x合成提供了表達系統(tǒng)，為實現(xiàn)代謝工程中三萜皂苷異源工業(yè)化生產(chǎn)提供了研究思路。在本實驗研究中重點研究金鐵鎖有效成分三萜皂苷合成的下游途徑，故選擇釀酒酵母作為底盤菌株。

4 小結(jié)

金鐵鎖的藥理作用主要表現(xiàn)為鎮(zhèn)痛、抗炎、抗類風濕、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗氧化等。近年對金鐵鎖的研究所獲皂苷類成分，目前被認為是主要的活性成分，較為集中的是齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物［3］。目前，利用合成生物學在釀酒酵母中構(gòu)建細胞工廠高效生產(chǎn)藥用植物有效成分已成為最環(huán)保、高產(chǎn)的手段。釀酒酵母體內(nèi)自身含有提供萜類化合物合成的MVA途徑，以其作為底盤菌株，在細胞色素P450單加氧酶對骨架進行結(jié)構(gòu)修飾下，最終獲得相關(guān)的三萜類皂苷化合物。

實驗室前期已完成了金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學分析工作，并完成了MVA途徑的修飾與合成，在酶的催化下，構(gòu)建出了高產(chǎn)金鐵鎖有效成分三萜皂苷的前體物質(zhì)齊墩果酸的工程菌株，再在釀酒酵母中實現(xiàn)金鐵鎖三萜皂苷元生物合成途徑異源重建，將金鐵鎖P450單加氧酶通過合成生物學方式將其在釀酒酵母中表達實現(xiàn)重建，構(gòu)建出高產(chǎn)藥用植物金鐵鎖有效成分的初級細胞工廠。

綜上所述，基于合成生物學方法在微生物體內(nèi)重建金鐵鎖三萜皂苷的生成途徑，實現(xiàn)金鐵鎖藥用有效成分生物合成途徑解析，并在此基礎(chǔ)上通過研究生物合成途徑和關(guān)鍵酶基因的挖掘鑒定與調(diào)控，可增加藥用植物有效成分的含量，提高中藥材的品質(zhì)，為中藥的良種選育、規(guī)范化種植和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。同時，通過金鐵鎖三萜皂苷人工細胞工廠的開發(fā)直接發(fā)酵法生產(chǎn)有效成分，是獲得新資源的又一重要補充。