苗茜，林根，徐海鵬，吳標，鄭曉彬，蔣侃，力超

350014 福州，福建省腫瘤醫(yī)院·福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 胸部內(nèi)科(苗茜、林根、徐海鵬、吳標、鄭曉彬、蔣侃)，病理科(力超)

免疫治療是目前肺癌治療領(lǐng)域里繼手術(shù)、化療、放療、靶向治療后新出現(xiàn)的極有潛力的新型治療方法。該方法通過使腫瘤免疫正?；瑴p少抗腫瘤的豁免，從而讓患者得到持續(xù)性的臨床獲益。程序性死亡受體1-蛋白及程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-1/PD-L1)抗體是在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中研究最多的免疫檢測點抑制劑。目前，PD-1及PD-L1抗體已被批準在晚期NSCLC臨床一線及二線使用。PD-L1檢測可用于預測PD-1/PD-L1抑制劑的優(yōu)勢人群，PD-L1表達越高，治療效果越好。Atezolizumab是針對PD-L1的人源化的IgG1單克隆抗體，目前已被批準在NSCLC中一線及二線使用[1-3]。PD-L1(SP142)VENTANA法是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的針對Atezolizumab使用PD-L1補充診斷檢測方法。與其他PD-L1檢測方法不同，該方法除了檢測腫瘤細胞(tumor cells,TC)中PD-L1的表達情況，還檢測了免疫細胞(immune cells,IC)中PD-L1表達情況，高表達的患者(即評價≥ 50% TC或者≥ 10% IC)可能從Atezolizumab的治療中延長生存[1]。我們通過檢測手術(shù)切除標本及其配對微陳列組織標本(tissue microarrays,TMA)的PD-L1(SP142 VENTANA法)表達情況，了解腫瘤內(nèi)PD-L1表達的一致性，并且進一步分析PD-L1的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本收集及臨床資料

納入2008年10月至2010年12月在福建省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的NSCLC患者，收集到經(jīng)福爾馬林固定及石蠟包埋的手術(shù)標本129例。術(shù)后分期根據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Commitfee on Cancer,AJCC)TNM系統(tǒng)進行分期，病理類型根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織肺癌診斷標本進行分類。患者均未在手術(shù)前接受過治療，所有患者未使用過免疫治療。

1.2 配對TMA的構(gòu)建

所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后做HE染色，病理專家作二次診斷，并在HE 切片上根據(jù)典型病理形態(tài)區(qū)域作標記,陣列制作利用組織芯片制作儀(Beecher Instruments.Inc)在受體蠟塊(空白蠟塊)上打孔(直徑2.0mm)，然后根據(jù)HE片上精確范圍在供體組織蠟塊相應位置獲取所要組織芯放入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號，重復上述步驟制成陣列塊4塊(共150點)，所得的組織芯片的每個點都經(jīng)過病理診斷。

1.3 染色與判讀

在獲得手術(shù)標本和配對的TMA后，將每個FFPE組織和TMA切成4μm，并使用兔單克隆抗體(克隆SP142; Ventana，Roche Group，Tucson，AZ)在自動染色平臺上進行免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)檢測(Benchmark ULTRA; Ventana)，使用濃度為1:60[1]。使用OptiView DAB IHC檢測試劑盒(Ventana)和OptiViewAmplification Kit(Ventana)來顯示結(jié)合的抗PD-L1一抗; 切片用蘇木精復染。IC表達被劃分為IC0vsIC1vsIC2vsIC3，TC1/2/3或IC1/2/3定義為腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境浸潤性免疫細胞中PD-L1表達大于等于1%，TC2/3或IC2/3定義為PD-L1表達大于等于5%；TC3定義為腫瘤細胞中PD-L1表達大于等于50%，而IC3定義為腫瘤微環(huán)境浸潤性免疫細胞中PD-L1表達大于等于10%；TC0與IC0為PD-L1表達不到1%?？傮w判讀時以TC與IC高分作為判讀，如TC3分及IC0分時，總體判讀仍為3分。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，描述性統(tǒng)計數(shù)據(jù)用于總結(jié)患者的人口統(tǒng)計學和結(jié)果。協(xié)議統(tǒng)計(Cohen的κ系數(shù))用于評估配對病變之間PD-L1表達的異質(zhì)性。一致性水平被歸類為差(≤0.4)、一般(0.40～0.75)和良好(≥0.75)。Fisher精確檢驗用于比較組內(nèi)的比例。以P<0.05為結(jié)果有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般臨床特征

129例患者中年齡大于60歲患者50例，占全部人群38.8%，小于60歲患者79例，占全部人群61.2%；男性88例，占全部人群68.2%，女性41例，占全部人群31.8%；既往吸煙史患者55例，占全部人群42.6%，不吸煙患者74例，占全部人群57.4%；病理鱗癌、肉瘤樣癌、腺癌及腺鱗癌分別45例、1例、70例及13例，占全部人群34.9%、0.8%、54.3%及10.1%；TNM(AJCC分期第7版)I期、II期、III期、IV期分別為28例、26例、60例及15例，占全部人群21.7%、20.2%、46.5%及11.6%(表1)。

表1 患者的一般臨床特征、病理類型及TNM分期

Table 1. General Clinical Characteristics, Pathological Types and TNM Stage of Patients

VariableNN %Age≤60y7961.2>60y5038.8

VariableNN %Sex Male8868.2Female4131.8Smoking historyNo7457.4Yes5542.6HistologySquamous cell carcinoma4534.9Sarcomatoid carcinoma10.8Adenocarcinoma7054.3Adenosquamous carcinoma1310.1TNM stageⅠ2821.7Ⅱ2620.2Ⅲ6046.5Ⅳ1511.6

2.2 手術(shù)標本與配對TMA中PD-L1表達比較

所有的標本中有59例(46.0%)手術(shù)標本判讀陽性(TC1/2/3和/或IC1/2/3)，而在相應配對的TMA中只有31例(24.0%)判讀陽性(TC1/2/3和/或IC1/2/3)；24例(18.7%)手術(shù)標本判讀陽性(TC2/3和/或IC2/3)，而在相應配對的TMA中只有18例(14.0%)判讀陽性(TC2/3和或IC2/3)；10例(8.7%)手術(shù)標本判讀強陽性(TC3和/或IC3)，在相應配對的TMA中有8例(6.2%)判讀強陽性(TC3和或IC3)，見表2和圖1(手術(shù)標本及TMA的TC均判讀強陽性)?？傮w不一致率為41.9%，k值等于0.235(一致性差)。 IC的不一致率遠高于TC(39.5%vs15.5%)，k值為0.113vs0.489(一致性差與中等一致性)?？傮w陰性(TC0/IC0)顯示出中度的不一致性為49.6%，100例(77.5%)在手術(shù)標本和配對TMA中均被認為是TC 0，然而，只有74例(57.4%)顯示出IC0的一致性。有3例手術(shù)標本判讀為IC3，但在配對TMA中未觀察到IC3。與低評分組(TC1/IC1)相比，可以看到高PD-L1評分組(TC3/TC2/IC3/IC2)具有更好的一致性。不同組織學亞型不一致率之間存在趨勢差異，鱗狀細胞癌(squamous cell carrcinoma,SCC)中TC1-3/IC1-3評分不一致率為33.3%(手術(shù)標本為46.7%陽性表達，配對TMA為26.7%陽性表達)，k值等于0.408；腺鱗癌(adenosquamous corr cinoma,ADC)中TC1-3 /IC1-3評分不一致率為48.5%(手術(shù)標本為45.2%陽性表達，配對TMA為22.6%陽性表達)，k值等于0.134(一致性差)；其他病理類型中TC1-3/IC1-3評分不一致率為為35.7%(手術(shù)標本為57.1%陽性表達，配對TMA為28.6%陽性表達)，k值等于0.444，詳見表2～4。在大部分標本中，配對TMA較手術(shù)標本都低評了PD-L1的表達，詳見圖2(手術(shù)標本的IC判讀強陽性，TMA的IC判讀陰性)。但是在少數(shù)幾個樣本中見到手術(shù)標本陰性或弱陽性而配對TMA判讀陽性，詳見圖3手術(shù)標本的TC判讀弱陽性，TMA判讀強陽性)。6例在手術(shù)標本中判讀陰性(TC0/IC0)的標本在配對TMA中判讀為陽性，2例判讀為TC1，4例判讀IC1。與TC相關(guān)的不一致率為31%，而與IC相關(guān)的不一致率為69%。分析中可見，在手術(shù)標本中IC陽性率(39%)高于TC陽性率(19%)，但是在TMA標本中IC與TC的陽性率都為15%，TC3與IC3的樣本并無關(guān)聯(lián)。

表2 手術(shù)標本與配對TMA標本最終 SP142判讀

Table 2. Final Interpretation of SP142 Stain in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+273502+53333+2125

2.3 PD-L1表達與總生存曲線的關(guān)系

就總生存期而言，無論是通過手術(shù)標本IHC染色結(jié)果來進行判斷(圖4)，還是通過配對TMA標本結(jié)果進行判斷，與PD-L1表達陰性的患者相比，表達PD-L1陽性(TC1/2/3和或IC1/2/3)的患者都沒有無優(yōu)勢，差異無統(tǒng)計學意義(55.2 個月vs55.1 個月，P=0.624；53.5個月vs55.2 個月，P=0.833)。

表3 手術(shù)標本與配對TMA標本TC SP142判讀

Table 3. Interpretation of SP142 Stain in Tumor Cells in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+61102+22333+2005

表4 手術(shù)標本與配對TMA標本IC SP142判讀

Table 4. Interpretation of SP142 Stain in Immune Cells in Surgical Specimens and Paired Tissue Microarrays

Surgical sampleChip sample-1+2+3+-1003101+61102+22333+0125

圖1 手術(shù)標本強陽性，配對TMA標本強陽性(TC)

Figure1.StronglyPositiveExpressioninBothSurgicalSpecimensandPairedTissueMicroarrays(TumorCells)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 expression is highly concordant between surgical specimens and paired TMA.

圖2 手術(shù)標本強陽性，配對TMA陰性 (IC)

Figure2.StronglyPositiveExpressioninSurgicalSpecimensandNegativeExpressioninPairedTissueMicroarrays(ImmuneCell)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 (SP142) expression in TMA specimens underestimate that in matched resected surgical specimens.

圖3 手術(shù)標本弱陽性，配對TMA強陽性(TC)

Figure3.WeaklyPositiveExpressioninSurgicalSpecimensandStronglyPositiveExpressioninPairedTissueMicroarrays(TumorCells)

Panel A and B show hematoxylin and eosin stain and immunohistochemical staining of PD-L1 (SP142) in surgical specimens and paired tissue microarrays. The red circle indicates the area of tissue microarrays in corresponding resected specimens. PD-L1 (SP142) expression in TMA specimens underestimate that in matched resected surgical specimens.

圖4 總生存期與手術(shù)標本中PD-L1表達情況的相關(guān)性

Figure4.CorrelationbetweenOverallSurvivalandPD-L1ExpressionofSurgicalSpecimen

圖5 總生存與TMA標本中PD-L1染色情況的相關(guān)性

Figure5.CorrelationbetweenOverallSurvivalandPD-L1ExpressionofTMASpecimen

3 討 論

在免疫治療的運用中，有效的療效預測因子有助于篩選能夠獲得最佳療效受益人群，也是廣受關(guān)注的熱點之一。PD-L1是目前研究和臨床中應用最多的生物標志物[4-5]，但是，由于PD-L1本身檢測試劑克隆號較多，不同檢測平臺以及不同的判讀標準等問題導致其“預測角色”需要謹慎而辯證地對待[6]。PD-L1主要表達在腫瘤細胞表面或腫瘤浸潤的微環(huán)境中，但不是所有腫瘤細胞都有表達PD-L1[3]，并且PD-L1的表達本身存在時間與空間的異質(zhì)性，即同一個患者不同時期的PD-L1的表達可能是不一致的，不同病灶之間甚至同一病灶之間都存在這種表達不一致的異質(zhì)性。因此，以檢測PD-L1表達情況作為預測免疫治療療效的指標時存在一定局限性，尤其目前臨床上對晚期肺癌患者往往使用穿刺小標本進行檢測，這會導致更加明顯的不穩(wěn)定性[7-8]。

目前臨床在進行PD-L1檢測時送檢的病理標本往往為氣管鏡或肺穿刺及淋巴結(jié)穿刺的小標本，小標本是否能夠完全代表整個腫瘤的PD-L1表達情況呢？本研究基于這個想法進行了初步探索。我們收集了129例手術(shù)標本，以手術(shù)標本來模擬整個腫瘤，配對TMA來模擬臨床送檢的小標本，通過檢測PD-L1表達的情況，探討兩者間一致性問題。TMA技術(shù)是將若干石蠟包埋塊上的各種組織轉(zhuǎn)移到一個新石蠟塊上重新構(gòu)建微型化高通量組織陣列的方法，可以有效地進行各類臨床病理組織的觀察和研究。TMA技術(shù)可以在一塊切片上同時放置幾十到一百個樣品，進行高通量的基因和蛋白質(zhì)分析，且能夠充分利用組織資源，將多個樣品的平行實驗一次性完成。這項技術(shù)近些年主要用于鑒定腫瘤特征的生物標志物，并可用于進行預測標志物篩選或通過回顧性研究尋找生物療法的潛在靶點[9-11]。

有幾項研究對NSCLC的手術(shù)標本及相應穿刺小標本進行了PD-L1表達的一致性探索，但大多數(shù)研究的結(jié)果都表現(xiàn)出不一致性。其中，僅有Kitazono等[12]的研究顯示了良好的一致性，該研究納入了79例患者，其手術(shù)標本與活檢小標本的一致性高達92%。但llie等[9]開展的另外一項研究納入了160例NSCLC患者，分析了手術(shù)前診斷小標本與術(shù)后標本的PD-L1表達情況，無論在TC還是IC的判讀上都有較差的一致性，在判讀陰性的小標本中與術(shù)后標本判讀的不一致性(57/128，46%)。Kitazono的研究使用的PD-L1檢測試劑與llie使用的檢測試劑克隆號不一致可能是導致結(jié)論差異較大的原因，Kitazono的研究使用的PD-L1檢測抗體為catalog no.4059，llie使用的PD-L1檢測抗體為SP142。本研究結(jié)果與llie研究相似(總體不一致率為41.9%)。在所有標本中，小標本均較手術(shù)標本低判了PD-L1的表達，這一點與絕大多數(shù)研究相似。本研究除了發(fā)現(xiàn)配對TMA低判PD-L1的表達的情況外，還發(fā)現(xiàn)了配對TMA標本高判的情況，這主要與腫瘤的異質(zhì)性特別是空間異質(zhì)性有關(guān)。本研究與llie均使用SP142進行PD-L1檢測，不同之處則在于本研究使用手術(shù)標本與其配對TMA進行比較，而非術(shù)前穿刺小標本，這在最大限度上減少了腫瘤的空間異質(zhì)性與時間異質(zhì)性。

另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)IC的不一致率遠高于TC(39.5%vs15.5%)，k值為0.113vs0.489(一致性差與中等一致性)。這種差異主要是病理學家對于IC的判讀困難造成的，TC通常顯示為膜染色，IC顯示為細胞質(zhì)染色，與小淋巴細胞形態(tài)難以鑒別，均表現(xiàn)為點狀信號，因此病理學家對于IC的判斷似乎更加困惑，這一點在既往研究及我們的研究中都可以看到[3]。

另外TC是陽性腫瘤細胞與腫瘤細胞總數(shù)的比值，IC的判讀是對于陽性細胞占腫瘤區(qū)域的比值，區(qū)域主觀性更強更模糊，除此之外，病理醫(yī)師對免疫細胞的觀察能力的不同，這些都導致不同病理科醫(yī)生的判讀結(jié)果一致性差。這一點在藍印計劃中同樣得到證實，病理學家在對任何抗體染色的TC進行評分時顯示出極好的一致性，但對用任何抗體染色的IC評分差異較大[7]。

在石蠟包埋組織的IHC研究中，在使用5%的細胞染色閾值判讀陽性標準時，不同文獻報道的PD-L1陽性表達范圍從19.6%到57.5%[12-14]。在我們的研究中，以同樣5%的細胞染色作為閾值判讀的陽性率僅為24例(18.7%)(TC3/2和/或IC3/2)，遠低于其他研究數(shù)據(jù)，這可能與本研究使用SP142抗體有關(guān)。Rimm等[13]的研究在2個獨立的染色平臺上評估了4種不同的PD-L1抗體，由多名病理科醫(yī)生盲態(tài)下對4種不同克隆號的PD-L1檢測判讀的一致性進行了比較，研究中比較了DakoLink 48平臺上的28-8抗體，Dako Link 48平臺上的22c3抗體，Ventana Benchmark平臺上的SP142抗體和Leica Bond平臺上的E1L3N抗體。在90個樣本中，SP142抗體的判讀與其余三個克隆號的判讀結(jié)果顯示了統(tǒng)計學上低判差異，而另外3個克隆號的判讀結(jié)果顯示了較好的一致性。一些研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達率可能與腫瘤分期、預后有關(guān)[14-17]，但2019年發(fā)布的EXPRESS研究結(jié)果則顯示PD-L1的表達與人種、年齡、性別、病理類型、吸煙史、原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶都沒有相關(guān)性，而是主要跟EGFR及ALK是否突變狀態(tài)有關(guān)，這是目前真實世界研究中關(guān)于PD-L1(22C3抗體)最大樣本量的數(shù)據(jù)。本研究為中國較大樣本量的真實數(shù)據(jù)研究，結(jié)果顯示，PD-L1的表達情況與患者的總生存情況也無相關(guān)性，與EXPRESS研究類似[18]。由于本研究樣本量較小，該結(jié)果尚需在規(guī)模更大的患者組中驗證。

PD-L1在TMA樣本中往往出現(xiàn)低判，這部分解釋了臨床治療時部分PD-L1陰性的患者接受免疫治療仍可能有效，因此在臨床活檢標本出現(xiàn)陰性的情況下，我們需慎重對待，盡可能多結(jié)合其他免疫預測指標綜合考慮，比如需要結(jié)合TMB等其他標志物避免遺漏獲益患者。本研究在避免了時間異質(zhì)性的基礎上手術(shù)標本與配對TMA仍表現(xiàn)出不一致性，這可能與空間異質(zhì)性有關(guān)，因此如果臨床操作可行的話，進行多點穿刺送檢標本的PD-L1表達可能更有指導意義。

我們的研究未對標本的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)及鼠類肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)情況進行評估，因此并未進一步分析PD-L1表達與EGFR、ALK及KRAS之間的關(guān)聯(lián)。有證據(jù)表明，驅(qū)動基因EGFR的突變激活免疫逃避，此外，EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療可下調(diào)PD-L1在NSCLC細胞系中的表達。這與目前研究中EGFR突變的患者PD1/PD-L1單抗治療效果欠佳有一定相符性[18]，EXPRESS中也提到EGFR突變患者免疫治療效果不好，各大指南中目前也是排除EGFR、ALK突變患者在一線使用免疫治療。另外，本研究為術(shù)后標本，生存預后主要與分期有關(guān)，因此在統(tǒng)計權(quán)重上占過多比例可能導致其他因素與預后的相關(guān)性不強。最后，本研究最大的局限性在于回顧性研究，且沒有PD-1/PD-L1單抗后續(xù)治療的進一步研究。

總體而言，在不盡如人意的臨床數(shù)據(jù)中大家認識到，盡管PD-L1不是一個最佳的生物標志物，但是在目前有限的預測指標中仍是可用的生物標志物。在強陽性的判讀中仍然有較好的指導意義，但是在中等陽性及陰性的判讀中，小標本是否能夠代表全身PD-L1表達狀態(tài)的意義需要慎重考慮，對于選擇優(yōu)勢人群或者剔除非優(yōu)勢人群仍然存在較大的困擾。多點穿刺標本減少空間異質(zhì)性可能值得在臨床進行推薦，這需要更多的臨床研究進一步證實。

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