張 永，田喬鵬，任海燕，歐陽汀蘭，胡 琪，管政兵，蔡宇杰，廖祥儒

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

隨著人們對動(dòng)物性制品的抵制和對高蛋白食品需求的提高，食用菌產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展，并產(chǎn)生了越來越多沒有得到充分利用的副產(chǎn)品——食用菌菌渣。2014年食用菌產(chǎn)量3 270萬t，其中杏鮑菇產(chǎn)量125萬t，按照食用菌平均生物學(xué)效率40%計(jì)算，杏鮑菇菌渣超過300萬t[1-2]。焚燒、堆積、填埋等傳統(tǒng)處理方式不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)也會(huì)帶來環(huán)境隱患[3]。

合成染料廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、印刷和化妝品行業(yè)。然而由于低效的印染工藝，大量含有染料的工業(yè)廢水被直接排放到了環(huán)境中[4]，由于很多染料具有生物毒性甚至致癌作用，染料廢水給生態(tài)環(huán)境帶來了很大隱患。目前處理工業(yè)染料廢水的方法主要包括物理吸附、光降解、化學(xué)降解等方法。但需要很大的資金和技術(shù)投入且容易帶來二次污染等問題[5]。生物修復(fù)的高效、不產(chǎn)生二次污染、費(fèi)用低、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到越來越多的重視[6]。

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，對酚類及其衍生物和非酚類化合物的氧化具有良好的催化作用[7-8]。由于底物的廣泛特異性，漆酶可以催化氧化工業(yè)上常用的絕大多數(shù)染料，且氧化過程的副產(chǎn)物只有水，因此在染料脫色和工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。

杏鮑菇屬于白腐菌類，具有很強(qiáng)的漆酶分泌能力，但目前尚未見到利用食用菌菌渣生產(chǎn)漆酶并利用發(fā)酵得到的粗酶液進(jìn)行染料脫色的報(bào)道。為進(jìn)一步開發(fā)杏鮑菇菌渣的利用，作者研究了碳源、氮源、誘導(dǎo)物對杏鮑菇菌渣產(chǎn)酶的影響，并利用發(fā)酵粗酶液探討了杏鮑菇漆酶在甲基紅、活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR脫色中的應(yīng)用，旨在為杏鮑菇菌渣在染料廢水的生物修復(fù)上提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 杏鮑菇菌渣和試劑杏鮑菇菌渣：當(dāng)?shù)仄髽I(yè)提供的采收一周內(nèi)的新鮮無雜菌生長的菌渣；甘蔗渣和稻稈：市售；其他有機(jī)和無機(jī)試劑：均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 初始培養(yǎng)基（g/L）酵母膏 4.0，KH2PO4 0.8，K2HPO4·7H2O 0.75，ZnSO4·7H2O 0.002，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，CuSO4·7H2O 0.02，CaCl2·2H2O 0.06，MnSO4·H2O 0.05；pH 6.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 杏鮑菇菌渣預(yù)處理將采收后的菌渣經(jīng)粉碎后過20目篩，收集備用。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)稱取50 g菌渣置于500 mL的培養(yǎng)瓶中，加入75 mL發(fā)酵初始培養(yǎng)基，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d。分別添加不同碳源（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的纖維二糖、木糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、半乳糖、4%甘蔗渣和4%稻稈）、不同氮源（0.4%的酵母膏、尿素、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、乙酸銨、草酸銨、鉬酸銨）和誘導(dǎo)物（1 mmol/L的鄰苯二酚、沒食子酸、香蘭素、愈創(chuàng)木酚、對氨基苯甲酸、0.5 g堿木素、0.5 g鈉木素和0.5 g木質(zhì)素）至發(fā)酵初始培養(yǎng)基誘導(dǎo)杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶。取10 g培養(yǎng)物加入90 mL水，在28℃、200 r/min搖床上振蕩2 h進(jìn)行混勻提取。取1 mL提取液在室溫下10 000 r/min離心5 min，得到的上清液即為粗酶液。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.3 漆酶酶活測定以DMP（2，6—二甲氧基酚）為底物測定漆酶活性，3 mL反應(yīng)體系中含有10 mmol/L DMP 0.5mL，0.1 mL粗酶液和 2.4 mL 50 mmol/L pH值3.0的磷酸—檸檬酸鈉緩沖液。在469 nm （DMP 的 ε=4.96×104mol/（L·cm））下測定反應(yīng)液 1 min內(nèi)的吸光值變化，1min氧化 1 μmol DMP所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。以每克干基料含有的酶活力U/gds表示固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物的酶活[10]。

1.2.4 發(fā)酵粗酶液對染料的降解以及脫色率的計(jì)算用紫外分光光度計(jì)對甲基紅、活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR溶液在200～800 nm內(nèi)進(jìn)行掃描確定最大吸收峰。隨后將以上4種染料作為漆酶粗酶液降解對象，探索合適的脫色條件，包括對介體（HBT、ABTS、1-對羥基苯甲酸、丁香醛）、pH值 （2.0～6.0 間隔1.0）和染料質(zhì)量濃度（300～700 mg/L間隔100）的選取。若無特定說明，脫色條件為：4 mL脫色反應(yīng)體系含3.3 mL、0.1 mol/L pH值3.0磷酸-檸檬酸鈉緩沖液、0.1 mL介體、0.1 mL染料（初始質(zhì)量濃度均為400 mg/L）、0.5 mL粗酶液 （10 U/mL），在40℃條件下處理12 h后，測定染料最大吸收波長處的吸光度At。以添加了熱滅活酶液的脫色體系作為對照組，測得其吸光值A(chǔ)0。染料脫色率的計(jì)算公式：其中，A0為對照組吸光值；At為脫色t時(shí)間后溶液的吸光值[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加物對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響

2.1.1 碳源對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響碳源為菌株的生長以及漆酶的合成提供碳骨架和能量。以不加碳源為對照組，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的纖維二糖、木糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、半乳糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的甘蔗渣和稻稈考察碳源對漆酶合成的影響，結(jié)果見圖1。單糖類對漆酶的合成有抑制作用，甘蔗渣和稻稈均能促進(jìn)漆酶產(chǎn)量的提高，其中加入甘蔗渣時(shí)漆酶活力最高，達(dá)73.6 U/gds。Daljit Singh Arora[11]和吳麗潔[12]等也發(fā)現(xiàn)甘蔗渣對白腐菌分泌漆酶有促進(jìn)作用。

圖1 碳源對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響Fig.1 Effects of carbon sources on laccase production

2.1.2 氮源對杏鮑菇菌渣合成漆酶的影響氮源對菌體的代謝過程有顯著的影響。以甘蔗渣為碳源，不加氮源為對照組，加入等質(zhì)量濃度的酵母膏、尿素、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、乙酸銨、草酸銨、鉬酸銨考察氮源對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響，結(jié)果見圖2。氮源的加入對杏鮑菇菌渣有明顯的促進(jìn)作用。其中以硝酸銨為氮源時(shí)，杏鮑菇菌渣漆酶活力達(dá)到最高，為180.2 U/gds。說明氮源對漆酶的合成有很大的影響[13]。

2.1.3 誘導(dǎo)物對杏鮑菇菌渣合成漆酶的影響許多誘導(dǎo)物能夠促進(jìn)漆酶的合成。在已優(yōu)化碳氮源基礎(chǔ)上，以不加誘導(dǎo)物為對照組，選擇小分子誘導(dǎo)物如鄰苯二酚、沒食子酸、香蘭素、愈創(chuàng)木酚、阿魏酸、對氨基苯甲酸和高分子誘導(dǎo)物如鈉木素、堿木素和木質(zhì)素考察各種化合物對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)作用，結(jié)果見圖3。鈉木素、堿木素和木質(zhì)素對漆酶合成的誘導(dǎo)作用明顯，其中堿木素作誘導(dǎo)物時(shí)酶活力達(dá)到386.9 U/gds，但此濃度下鄰苯二酚和沒食子酸對菌渣產(chǎn)漆酶沒有促進(jìn)作用。Munoz[14]等此前也發(fā)現(xiàn)堿木素對杏鮑菇發(fā)酵生產(chǎn)漆酶有良好的誘導(dǎo)作用。

圖2 氮源對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on laccase production

圖3 誘導(dǎo)物對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響Fig.3 Effects of inducers on laccase production

2.2 漆酶粗酶液對染料的脫色降解

2.2.1 染料最大吸收波長的確定通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，甲基紅、活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán) KNR 分別在 490、607、610、589 nm 處具有最大吸收波長，且重現(xiàn)性較好。

2.2.2 小分子介體對染料脫色的影響加入不同介體后測定各個(gè)染料的脫色率，以研究不同介體對染料脫色的影響，結(jié)果見圖4。HBT、ABTS、1-對羥基苯甲酸、丁香醛4種介體對甲基紅和活性艷藍(lán)K3R的降解無明顯提高，而ABTS、1-對羥基苯甲酸分別對酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR的降解有很大促進(jìn)作用，使二者的脫色率分別達(dá)到80.5%和85.0%。在無介體存在的條件下，各染料脫色率均超過60%，其中甲基紅達(dá)到78.3%，要高于添加介體組。甲基紅屬于偶氮類染料，在沒有介體參與的情況下很難被漆酶直接脫色，可能是因?yàn)榇置敢褐泻行》肿诱婢x物充當(dāng)介體的作用[15]。

圖4 小分子介體對染料脫色的影響Fig.4 Effects of small molecule mediators on decolorization

2.2.3 反應(yīng)體系pH對染料脫色的影響將甲基紅和添加了最適介體的活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR分別置于不同pH值下反應(yīng)，探索不同pH值對染料脫色的影響，結(jié)果見圖5。甲基紅最適降解pH為2.0，活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209最適降解pH范圍分別為2.0～4.0、2.0～3.0，此范圍內(nèi)染料降解率均超過85%。而活性艷藍(lán)KNR在pH值2.0～6.0范圍內(nèi)脫色率均超過68%。杏鮑菇漆酶在pH 3～10范圍內(nèi)活性比較穩(wěn)定[14]，當(dāng)pH超過合適范圍時(shí)，脫色率有明顯下降?？赡苁且?yàn)椴煌琾H值會(huì)影響酶與染料的親和力，從而影響脫色效果[16]。

在無介體條件下，活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR最適pH范圍與介體存在的條件相同。其中活性艷藍(lán)K3R在pH 3、酸性藍(lán)209在pH 2、活性艷藍(lán)KNR在pH 4時(shí)脫色率達(dá)到最大，分別為82.7%、66.3%、69.6%。

圖5 反應(yīng)體系pH對染料脫色的影響Fig.5 Effects of pH of the reaction system on decolorization

2.2.4 染料濃度對脫色的影響在最優(yōu)條件下的反應(yīng)體系中添加不同濃度的染料，測定脫色率，研究不同染料濃度對染料降解的影響，結(jié)果見圖6。4種染料質(zhì)量濃度在300～700 mg/L范圍內(nèi)的降解率均超過80%。其中酸性藍(lán)209在300 mg/L時(shí)降解率為92.7%，說明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，10 U/mL漆酶均可以起到良好的脫色作用。

圖6 染料質(zhì)量濃度對脫色影響Fig.6 Effects of dye concentration on decolorization

在沒有添加介體存在的情況下，在300～700 mg/L范圍內(nèi)活性艷藍(lán)K3R的脫色率均超過80%，在300 mg/L時(shí)達(dá)到85.6%；酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)KNR脫色率均超過65%，其中酸性藍(lán)209在500 mg/L時(shí)脫色率達(dá)68.3%，活性艷藍(lán)KNR在300 mg/L時(shí)脫色率最高，為71.2%。

3 結(jié) 語

食用菌能夠分泌木質(zhì)纖維素酶，在生物修復(fù)過程中扮演著重要的角色，雖然在栽培過程中只能少量產(chǎn)生，但碳源、氮源及其他誘導(dǎo)物可以明顯影響酶的分泌[17-19]。此外，杏鮑菇在生產(chǎn)過程中一般只收獲一茬，相對于其他菌類的栽培過程，杏鮑菇菌渣殘留大量成熟的能夠分泌木質(zhì)纖維素酶的菌絲[20]。本實(shí)驗(yàn)首次以杏鮑菇菌渣發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，研究了營養(yǎng)條件以及誘導(dǎo)物的加入對杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的影響。結(jié)果表明，甘蔗渣和硝酸銨分別作為杏鮑菇菌渣產(chǎn)漆酶的碳源和氮源時(shí)效果最好，最佳誘導(dǎo)物是堿木素。發(fā)酵粗酶液脫色實(shí)驗(yàn)表明，4種小分子介體中ABTS對酸性藍(lán)209、1-對羥基苯甲酸對活性艷藍(lán)KNR的脫色具有最好的促進(jìn)作用。甲基紅最適降解pH值為2.0，活性艷藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209在pH大于4.0時(shí)脫色率明顯下降，活性艷藍(lán)KNR在pH 2～6范圍內(nèi)受pH值影響較小。在合適的介體和pH值下，4種染料質(zhì)量濃度在300～700 mg/L區(qū)間范圍內(nèi)的降解率均超過80%?；钚云G藍(lán)K3R、酸性藍(lán)209和活性艷藍(lán)在不添加介體的條件下脫色率均超過65%，其中活性艷藍(lán)K3R脫色率達(dá)到85.6%，顯示出漆酶對染料廢水良好的生物修復(fù)潛力。

食用菌菌渣除了對印染廢水進(jìn)行脫色處理，在其他生物學(xué)修復(fù)領(lǐng)域也有巨大潛力[3]，提高菌渣漆酶含量可以有效地提高食用菌菌渣的生物修復(fù)效率。