(安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，蕪湖 241000)

貓爪草為毛莨科植物小毛莨的塊根，具有調(diào)免疫、抗腫瘤、抗氧化等作用[1-2]，免疫活性部位的篩選試驗表明多糖是其重要活性成分之一。采用水提醇沉法所得的貓爪草粗多糖中含有大量色素，需進一步精制純化?；诖?，本文探討了雙氧水脫除貓爪草多糖色素的工藝條件，并利用正交試驗進行優(yōu)化，以期為貓爪草多糖的脫色處理提供參考。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

貓爪草購于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校汪榮斌教授鑒定為毛莨科植物小毛莨的塊根；FA1204N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安禾普生物科技有限公司)；80-2B離心機(湖南星科科學儀器有限公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司)；苯酚、無水乙醇、雙氧水(質(zhì)量濃度30%)等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1貓爪草多糖的制備 將貓爪草粉碎后用石油醚回流脫脂3次，每次6h。而后加20倍量水，于90℃提取2次，每次2h。合并上清液并減壓濃縮，加4倍體積無水乙醇，冷藏過夜。收集沉淀得貓爪草粗多糖。用蒸餾水溶解至1.0mg/ml，作待脫色液備用。

1.2.2多糖含量測定-苯酚硫酸法 具體方法參見文獻[3]。

1.2.3多糖保留率與色素脫除率的計算

(1)

(2)

式1中，M1示脫色之前多糖質(zhì)量，M2示脫色之后多糖質(zhì)量。式2中，A1示脫色處理之前溶液450 nm處的吸光度，A2示脫色處理之后溶液450 nm處的吸光度。

1.2.4單因素試驗 取50ml待脫色液5份，以脫色率及多糖保留率為指標，考察脫色時間(20、40、60、80、100min)、脫色pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、脫色溫度(35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)、雙氧水用量(5%、10%、15%、20%、25%)4個因素對貓爪草多糖脫色效果的影響。

1.2.5正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定pH 9.0，以多糖脫色率為考察指標，選擇脫色時間(A)、脫色溫度(B)、雙氧水用量(C)進行三因素三水平正交試驗，優(yōu)化貓爪草多糖脫色工藝，各因素水平安排如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色時間對貓爪草多糖脫色效果的影響

在20～60min的脫色時間范圍內(nèi)，隨著時間的延長，貓爪草多糖脫色率迅速從45.4%提高至78.9%。但60 min以后，脫色率變化較小。而多糖保留率隨脫色時間的延長不斷降低，且60min后降低速度加快。可能原因是雙氧水氧化色素同時也在氧化多糖，脫色時間越長多糖損失越多。因此，應(yīng)選擇脫色時間為60min較為適宜。見圖1。

2.2 脫色pH對貓爪草多糖脫色效果的影響

貓爪草多糖的脫色率隨pH值的升高而逐漸提高。pH 6.0時，脫色率64.1%，pH 9.0時，脫色率78.3%。此后繼續(xù)增加pH至10.0時，脫色率幾乎保持不變。H2O2在水溶液中可電離出過氧氫根離子攻擊色素，且在堿性介質(zhì)中其電離度增大。因此，提高pH可增強雙氧水的脫色作用。多糖保留率則受pH影響較小，穩(wěn)定在71.9%～75.1%之間，故應(yīng)選擇pH為9.0較為適宜。見圖2。

圖1 脫色時間對貓爪草多糖脫色效果的影響

圖2 脫色pH對貓爪草多糖脫色效果的影響

2.3 脫色溫度對貓爪草多糖脫色效果的影響

提高溫度可增加脫色率，因為高溫可加快自由基的離解，利于脫色。所以當溫度從35℃升高至55℃時，脫色率提高了1.2倍，達到78.2%。但過高的溫度同時也會促進自由基自身的分解，不利于脫色。所以，當溫度超過55℃后，脫色率開始降低。與此同時，多糖保留率幾乎不變，所以，綜合考慮應(yīng)選擇脫色溫度為55℃。見圖3。

圖3 脫色溫度對貓爪草多糖脫色效果的影響

2.4 雙氧水用量對貓爪草多糖脫色效果的影響

當雙氧水用量5%時，脫色率40.8%，而雙氧水用量20%時，脫色率78.2%，提高了1.9倍。主要原因是當雙氧水濃度較低時，分解速度較慢，因而脫色效果相對較差。但繼續(xù)增加雙氧水的用量，脫色率變化不大，與此同時多糖保留率迅速降低，因過量的雙氧水會導致多糖的氧化降解。因此，應(yīng)選擇雙氧水的用量為20%較為適宜。

圖4 雙氧水用量對貓爪草多糖脫色效果的影響

2.5 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果及方差分析如表2、3所示，可知對貓爪草多糖雙氧水脫色率影響大小的順序為：雙氧水用量>脫色時間>脫色溫度 ，但三個因素中只有雙氧水用量對貓爪草多糖脫色率影響顯著(P<0.05)。最優(yōu)工藝組合為A1B1C3，即脫色時間60 min、脫色溫度45 ℃、雙氧水用量25%。但由單因素考察可知，雙氧水用量達25%時，多糖保留率降低，因此,綜合考慮脫色率與多糖保留率，選擇雙氧水用量為20%。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

為驗證雙氧水脫色工藝的穩(wěn)定性和可信度，在最優(yōu)條件下進行3次平行試驗。見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果

3組平行試驗結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，且多糖保留率相對較高，表明該脫色工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

目前，常用的多糖脫色方法包括吸附法、化學法、離子交換法等。龔敏等[5]采用大孔樹脂對藥桑多糖脫色后發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性有所增強；蔣俊等[6]報道了猴頭菌大孔樹脂脫色多糖對胃黏膜的損傷修復作用顯著提高；但肖平等[7]用活性炭對板藍根多糖脫色后發(fā)現(xiàn)其清除自由基的能力降低。因此，脫色方法的選擇除考慮脫色率、多糖保留率以外，還應(yīng)評估其對多糖結(jié)構(gòu)與活性的影響。

本文采用雙氧水對貓爪草多糖進行脫色，考察了脫色時間、pH、脫色溫度、雙氧水用量對脫色率及多糖保留率的影響，并通過正交試驗對工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，雙氧水用量對脫色率有顯著影響，在脫色時間60 min、pH 9.0、脫色溫度45℃、雙氧水用量20%的條件下，貓爪草多糖的雙氧水脫色率為79.7%，多糖保留率為74.3%。但雙氧水為強氧化劑，從單因素考察可知其可能導致多糖氧化降解，故下一步將結(jié)合多糖的結(jié)構(gòu)分析與活性研究，更為深入地探討雙氧水的脫色影響。