竇同璐，陳 浩，曹 津，陳俊升，朱建偉

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海 200240)

內(nèi)含肽 (intein)可以催化蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)[1]，將其自身從前體蛋白中自我剪除的同時(shí)將其兩端的外顯肽(extein)以肽鍵相連[2-3]。盡管內(nèi)含肽通常是以連續(xù)的形式存在，但是某些內(nèi)含肽在天然狀態(tài)下是以斷裂的形式存在的[4-6]。這些天然存在的斷裂內(nèi)含肽可以催化蛋白質(zhì)反式連接，將兩個(gè)外顯肽連接成一個(gè)新的蛋白質(zhì)，并且此過程無需其他外部能量[7-8]。

蛋白質(zhì)反式剪接(protein trans-splicing,PTS)目前已經(jīng)在蛋白質(zhì)剪切和連接的過程中得到廣泛的應(yīng)用[9]，如蛋白質(zhì)的純化[10]，免疫毒素非特異性毒性的降低[11]，蛋白質(zhì)的環(huán)化[12]及體內(nèi)蛋白質(zhì)工程[13]等。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合這一技術(shù)，開發(fā)出一種基于斷裂內(nèi)含肽的雙特異性抗體裝配系統(tǒng)，可以很好的解決雙特異性抗體輕重鏈錯(cuò)配的問題[14-15]，此平臺(tái)的建立為雙特異性抗體藥物的工業(yè)制備提供了技術(shù)支持。但值得注意的是，天然的斷裂內(nèi)含肽與外顯肽連接時(shí)，通常在C-末端連接處含有保守的“CFN”三肽序列，它們是C末端外顯肽序列的前3個(gè)氨基酸[16]。這3個(gè)氨基酸在剪接后仍保留在剪接反應(yīng)產(chǎn)物中[6,17]，這意味著最終的產(chǎn)物引入了外源氨基酸而可能影響抗體藥物的質(zhì)量。

為了解決這一問題，本課題組探究尋找不引入外源氨基酸的斷裂內(nèi)含肽剪接斷開位點(diǎn)?！癒SCDKTHT”是一段來自于人IgG1型抗體鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，以“KS/CDK”為斷開位點(diǎn)可以很好的解決引入外源氨基酸的問題。但是，天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性高度依賴于外顯肽，當(dāng)C末端外顯肽前3位氨基酸為天然氨基酸序列即“CFN”時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子表現(xiàn)出高剪接活性[18-19]，而當(dāng)C末端外顯肽序列為非天然氨基酸序列時(shí)，會(huì)使斷裂內(nèi)含肽活性降低甚至喪失[17]，而尋求“CDK”為斷開位點(diǎn)高效剪接的天然斷裂內(nèi)含肽比較困難。本研究希望結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，以對(duì)野生型斷裂內(nèi)含肽第122位到124位進(jìn)行突變，使其可以識(shí)別“CDK”序列，在不引入抗體外源氨基酸的情況下使斷裂內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)得以順利發(fā)生。這將能夠幫助指導(dǎo)斷裂內(nèi)含肽在雙特異性抗體裝配的實(shí)際應(yīng)用，并有助于為更多復(fù)雜的工程內(nèi)含肽的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)(上海唯地生物技術(shù)有限公司)；包含抗體CH1片段的質(zhì)粒pET30a/CH1、包含斷裂內(nèi)含肽NpuDnaE的質(zhì)粒pET28a/NpuDnaE和包含綠色熒光蛋白(eGFP)的質(zhì)粒pET28a/eGFP均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與試劑

DNA凝膠電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；蛋白凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；PCR所用DNA聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶(大連寶生物工程有限公司)；同源重組試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒(美國(guó)Axygen公司)；ECL發(fā)光顯色液(美國(guó)Millipore生物公司)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,美國(guó)Sigma公司)；抗硫氧還蛋白抗體(anti-T)、抗組氨酸標(biāo)簽抗體(anti-His)、抗綠色熒光蛋白抗體(anti-eGFP)和羊抗鼠二抗(goat anti-mouse IgG)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成及測(cè)序服務(wù)由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供。

2 方 法

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究使用抗體片段CH1和模式蛋白eGFP作為外顯肽，在原核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)內(nèi)含肽與外顯肽融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)中用到的引物見表1。

2.1.1 CH1-NpuN重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 使用引物1(含限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ位點(diǎn))和引物2從pET30a/CH1中通過PCR擴(kuò)增CH1片段。使用引物3(含限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ位點(diǎn))和引物4從pET28a/NpuDnaE中擴(kuò)增NpuN片段基因，通過重疊PCR連接CH1片段和NpuN片段，將產(chǎn)物用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后，使用DNA連接酶將產(chǎn)物與經(jīng)過EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的pET32a質(zhì)粒相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落并送測(cè)序。

2.1.2NpuC-CFN-eGFP和NpuC-CDK-eGFP野生型及突變型重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 C端野生型重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以pET28a/NpuC-CDK-eGFP為例，使用引物5和引物6從pET28a/NpuDnaE中PCR擴(kuò)增NpuC片段基因。使用引物7和引物10從pET28a/eGFP中通過PCR擴(kuò)增eGFP片段。通過重疊PCR連接NpuC片段和eGFP(CDK)片段，將產(chǎn)物使用同源重組的方法連入pET28a中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，提取質(zhì)粒后測(cè)序鑒定。pET28a/NpuC-CFN-eGFP重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用引物5、8、9和10，其余步驟與上述過程相同。

C端突變型重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以pET28a/NpuC*GEP-CDK-eGFP為例，以pET28a/NpuC-CDK-eGFP重組質(zhì)粒為模版，將NpuC第122-124位氨基酸由谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸(ERD)突變?yōu)楦拾彼帷⒐劝彼岷透彼?GEP)。以引物11和12對(duì)pET28a/NpuC-CDK-eGFP重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的PCR產(chǎn)物使用DpnⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，之后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落并送測(cè)序。NpuC-CFN-eGFP突變體的構(gòu)建以pET28a/NpuC-CFN-eGFP重組質(zhì)粒為模板，其余構(gòu)建步驟同上。

Table1 Primers used in the experiment

No.NameSequence1CH1-F5′-CCGGAATTCGCGTCGACGAAGGGG-3′2CH1-NpuN-R15′-TTCATAGCTTAAACACTTGTCGCAGCTCTT-3′3CH1-NpuN-F25′-AAGAGCTGCGACAAGTGTTTAAGCTATGAA-3′4CH1-NpuN-R25′-GCGAAGCTTTTAATTCGGC-35NpuC-eGFP-F15′-AGAAGGAGATATACATATGATCAAAATAGCCACA-3′6NpuC-CDK-eGFP-R15′-AACTCCAATGTCATAGACATTTTGTTTGCCTAAATATTT-3′7NpuC-CDK-eGFP-F25′-AATGTCTATGACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTT-3′8NpuC-CFN-eGFP-R15′-AATTTTATCGCTCATGTTAAAACAATTAGAAGCTATGAA-3′9NpuC-CFN-eGFP-F25′-TTCATAGCTTCTAATTGTTTTAACATGAGCGATAAAATT-3′10NpuC-eGFP-R25′-ATGAGTGACGACTGATTTATCACAATTAGAAGCTAT-3′11NpuC-GEP-F5′-ATTGGAGTTGGTGAACCGCATAATTTTGCACTCAAAAAT-3′12NpuC-GEP-R5′-AAAATTATGCGGTTCACCAACTCCAATGTCATAGACATT-3′

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將以上所得重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL 21(DE3)中得到相應(yīng)重組蛋白表達(dá)菌株(見表2)。挑取單菌落分別接種至含有對(duì)應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下過夜培養(yǎng)。在LB培養(yǎng)基500 mL中1∶100接種過夜培養(yǎng)的種子液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)A600達(dá)到0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L并過夜誘導(dǎo)(25 ℃，180 r/min)。

Table2 Proteins expressed in this study

RecombinantproteincompositionShortnameTheoreticalmolecularweight/kDTrx-6×His·tag-CH1-NpuN-6×HisCH1-NpuN40NpuC-CDK-eGFP-6×HisNpuC-CDK-eGFP33NpuC-CFN-eGFP-6×HisNpuC-CFN-eGFP33NpuC?GEP-CDK-eGFP-6×HisNpuC?dGEP-CDK-eGFP33NpuC?GEP-CFN-eGFP-6×HisNpuC?GEP-CFN-eGFP33

2.2.2 重組蛋白純化 過夜誘導(dǎo)后，4 000 r/min離心15 min收集菌體，配制純化用上樣緩沖液(20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl，pH 7.4)，用其將沉淀菌體重懸，用高壓勻質(zhì)機(jī)加壓至900 bar(1 bar=0.1 MPa)，4 ℃破碎3 min后逐漸減壓并收集菌液。后迅速在離心機(jī)內(nèi)4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液放置在冰上備用，收集裂菌沉淀并制備蛋白電泳樣品。使用上樣緩沖液與2 mol/L咪唑母液梯度稀釋配制洗脫緩沖液，進(jìn)行梯度洗脫。取大腸埃希菌BL 21(DE3)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、裂菌沉淀、裂菌上清液、純化過程中的流穿及各洗脫濃度下收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

2.3 內(nèi)含肽的體外剪接反應(yīng)的探究

2.3.1 內(nèi)含肽的體外剪接反應(yīng)的檢測(cè) N末端反應(yīng)底物為CH1-NpuN，分別與C末端反應(yīng)底物NpuC-CFN-eGFP，NpuC-CDK-eGFP，NpuC*GEP-CDK-eGFP和NpuC*GEP-CDK-eGFP以1∶1物質(zhì)的量比混合，加入二硫蘇糖醇(DTT)的終濃度為1 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)的終濃度為1 mmol/L，37 ℃反應(yīng)2 h。其中，陽性對(duì)照的反應(yīng)組合為CH1-NpuN與NpuC-CFN-eGFP反應(yīng)。

以上剪接反應(yīng)均加入蛋白電泳的5×上樣緩沖液終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用Western blot檢測(cè)，分別使用抗硫氧還蛋白抗體(anti-T)、抗組氨酸抗體(anti-His)和抗綠色熒光蛋白抗體(anti-eGFP)作為一抗。隨后，用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 質(zhì)譜鑒定酶解肽段相對(duì)分子質(zhì)量 分別對(duì)CH1-NpuN與NpuC*GEP-CDK-eGFP發(fā)生的內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)后和CH1-NpuN與NpuC-CFN-eGFP發(fā)生的內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)后的體系進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。蛋白膠經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)法染色及脫色后，在對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量位置切割反應(yīng)產(chǎn)物條帶，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，使用納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定肽段的氨基酸構(gòu)成。質(zhì)譜分析由上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心完成。

2.3.3 影響斷裂內(nèi)含肽剪接反應(yīng)因素的探究

為了進(jìn)一步研究改造后斷裂內(nèi)含肽的剪接活性，本文對(duì)影響其反應(yīng)產(chǎn)物生成率的4個(gè)因素進(jìn)行考察，分別是NaCl濃度、pH、DTT濃度和溫度。通過不同條件下斷裂內(nèi)含肽剪接產(chǎn)物生成率的比較，考察構(gòu)建的突變型斷裂內(nèi)含肽對(duì)剪接反應(yīng)不同條件的耐受度。

反應(yīng)初始條件均為在25 ℃，pH 7.4，DTT終濃度1 mmol/L，內(nèi)含肽剪接反應(yīng)2 h后取樣。加入5× 上樣緩沖液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用Image J軟件掃描SDS-PAGE電泳圖上對(duì)應(yīng)條帶的光密度并將內(nèi)含肽剪接反應(yīng)產(chǎn)物生成率繪制成柱形圖，產(chǎn)物生成率計(jì)算公式如下：

產(chǎn)物生成率(%)=目的條帶的光密度/所有條帶的光密度×100。

分別選取NaCl為0、50、150、250、和500 mmol/L的剪接條件來研究NaCl對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的影響。以NaCl濃度為橫坐標(biāo)，內(nèi)含肽剪接效率為縱坐標(biāo)，繪制剪接效率隨NaCl濃度變化柱狀圖。分別選取pH為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5和9.0的剪接條件來研究pH對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的影響。以pH為橫坐標(biāo)，內(nèi)含肽剪接效率為縱坐標(biāo)，繪制剪接效率隨pH變化柱狀圖。分別選取DTT濃度為1、2和4 mmol/L來研究DTT濃度對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的影響。以DTT濃度為橫坐標(biāo)，內(nèi)含肽剪接效率為縱坐標(biāo)，繪制剪接效率隨DTT濃度變化柱狀圖。

分別選取溫度為4 ℃，25 ℃，30 ℃，37 ℃的剪接條件來研究溫度對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的影響。分別在內(nèi)含肽剪接反應(yīng)0，5，10，20，30，60，120，180，900，1 440 min時(shí)間點(diǎn)取樣。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，內(nèi)含肽剪接效率為縱坐標(biāo)，繪制不同溫度下剪接效率隨時(shí)間變化的曲線。

3 結(jié) 果

3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

CH1-NpuN重疊PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示獲得了600 bp左右的產(chǎn)物，與目的片段大小一致(圖1-A)。NpuC-CFN-eGFP和NpuC-CDK-eGFP的重疊PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在750 bp附近出現(xiàn)了單一、銳利條帶，與目的片段大小一致(圖1-B)。突變的NpuC*GEP-CFN-eGFP和NpuC*GEP-CDK-eGFP的PCR產(chǎn)物消化處理后經(jīng)1%DNA瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在5 000 bp以上出現(xiàn)了2條清晰銳利的條帶，與目的片段大小一致(圖1-C)。以上結(jié)果經(jīng)過測(cè)序后均正確。

3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

將大腸埃希菌BL 21(DE3)作為宿主細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。蛋白經(jīng)過鎳柱純化后，使用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。由圖2可知對(duì)于內(nèi)含肽C端反應(yīng)底物CH1-NpuN，在40 kD處出現(xiàn)單一條帶，符合預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量。在60 mmol/L咪唑洗脫下濃度及純度較高，利用超濾管將洗脫液濃縮，以待下一步反應(yīng)。

Figure1 Detection of the PCR products by agarose gel electrophoresis

A:1.CH1-NpuN;B:1.NpuC- CFN-eGFP;2.NpuC- CDK-eGFP;C:1.NpuC*GEP-CFN-eGFP;2.NpuC*GEP-CDK-eGFP

Figure2 SDS-PAGE of CH1-NpuN purification,using Ni column,elution from 20 mmol/L imidazole to 500 mmol/L imidazole

1:Bacteria before adding IPTG;2:Supernatant;3:Flow through,M.marker;4:40 mmol/L imidazole elution;5:60 mmol/L imidazole elution;6:80 mmol/L imidazole elution;7:100 mmol/L imidazole elution;8:200 mmol/L imidazole elution;9:500 mmol/L imidazole elution

由SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖3)可以看出，對(duì)于內(nèi)含肽C端反應(yīng)底物，使用鎳柱梯度咪唑純化后，在33 kD處出現(xiàn)單一條帶，符合預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量。由泳道6可以看出，在20 mmol/L咪唑洗脫下雜蛋白含量較高。由泳道9可以看出，在100 mmol/L咪唑洗脫下濃度及純度較高，因此將在此濃度洗脫下的蛋白收集后利用超濾管濃縮，以待下一步反應(yīng)。

3.3 內(nèi)含肽的體外剪接反應(yīng)的探究

3.3.1 內(nèi)含肽的體外剪接反應(yīng)的檢測(cè) Western blot結(jié)果顯示，NpuN-CH1與NpuC-CFN-eGFP剪接后在56 kD處出現(xiàn)新條帶，符合剪接產(chǎn)物CH1-eGFP 的理論相對(duì)分子質(zhì)量大小[(圖4-A(泳道3)，圖4-B(泳道4)，圖4-C(泳道4)]。NpuN-CH1與NpuC-CDK-eGFP混合后加入DTT誘導(dǎo)，在相應(yīng)位置并未出現(xiàn)新條帶[圖4-B(泳道6)，圖4-C(泳道6)]，表明野生型NpuDnaE不能夠識(shí)別前3位為CDK的C端外顯肽，反式剪接反應(yīng)無法進(jìn)行。NpuN-CH1與NpuC*GEP-CDK-eGFP的反應(yīng)體系內(nèi)檢測(cè)到56 kD處出現(xiàn)了新條帶，大小符合剪接產(chǎn)物CH1-CDK-eGFP的理論相對(duì)分子質(zhì)量[(圖4-A(泳道2)，圖4-B(泳道2)，圖4-C(泳道2)]。表明將122～124位的ERD突變?yōu)镚EP的NpuDnaE突變體能夠識(shí)別前3位為CDK的C端外顯肽，進(jìn)而發(fā)生反式剪接。

Figure3 SDS-PAGE analysis ofNpuC fusion protein purification

A:NpuC*GEP-CDK-eGFP;B:NpuC-CDK-eGFP;C:NpuC*GEP-CFN-eGFP;D:NpuC-CFN-eGFP purification,using Ni column,elution from 20 mmol/L imidazole to 500 mmol/L imidazole

1：Protein expression before induction;2：Protein expression after induction;3：Sediment;4：Supernatant;5：Flow through;6：20 mmol/L imidazole elution;7：40 mmol/L imidazole elution;8：60 mmol/L imidazole elution;9：100 mmol/L imidazole elution;10：200 mmol/L imidazole elution;11：500 mmol/L imidazole elution

Figure4 Western Blot of intein splicing reaction

A:anti-Trx antibody.1.CH1-NpuN;2.CH1-(Npu*GEP)-CDK-eGFP;3.CH1-(Npu)-CFN-eGFP;4.CH1-(Npu)-CDK-eGFP

B:anti-his antibody;C:anti-GFP antibody.1.NpuC*GEP-CDK-eGFP;2.CH1-Npu*GEP-CDK-eGFP;3.NpuC-CFN-eGFP;4.CH1-(Npu)-CFN-eGFP;5.NpuC-CDK-eGFP;6.CH1-(Npu)-CDK-eGFP

用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)(圖5)，可以看出，CH1-NpuN與NpuC*GEP-CDK-eGFP發(fā)生的內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)，不僅可以在Western Blot中被檢測(cè)出，也可以在SDS-PAGE中被檢測(cè)出。CH1-eGFP理論相對(duì)分子質(zhì)量為56 kD，反應(yīng)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量大小與陽性對(duì)照一致。

Figure5 SDS-PAGE of intein splicing reaction

1:CH1-NpuN;2:NpuC-CFN-eGFP;3:CH1-(Npu)-CFN-eGFP reaction;4:NpuC*GEP-CFN-eGFP;5:CH1-(Npu*GEP)-CFN-eGFP reaction;6:NpuC*GEP-CDK-eGFP;7:CH1-(Npu*GEP)-CDK-eGFP sreaction

3.3.2 質(zhì)譜鑒定酶解肽段相對(duì)分子質(zhì)量 CH1-NpuN與NpuC*GEP-CDK-eGFP發(fā)生的內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)后和CH1-NpuN與NpuC-CFN-eGFP發(fā)生的內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)后，這2個(gè)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過酶解后，分別可以檢測(cè)到包含有“CDK”和“CFN”的肽段，肽段的理論相對(duì)分子質(zhì)量和實(shí)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量見表3，說明產(chǎn)生了本研究預(yù)期的反應(yīng)產(chǎn)物，突變后的斷裂內(nèi)含肽可以成功識(shí)別C末端前3位氨基酸為“CDK”的外顯肽。

Table3 LC/MS identification of the splicing products

PeptidessequenceTheoreticalmolecularweight/kDMeasuredmolecularweight/kDKVEPPKSCFNMSK1568.744731568.75188VEPPKSCDK1059.513921059.51038

3.3.3 影響斷裂內(nèi)含肽剪接反應(yīng)因素的探究 對(duì)于內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的考察中(圖6)，NaCl濃度為0～500 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物生成率為33.6%～47.8%。DTT濃度在1～4 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物生成率為47.4%～54.1%。pH為6～9時(shí)，產(chǎn)物生成率為38.3%～51.1%。

由圖7可以看出，對(duì)于溫度影響內(nèi)含肽剪接反應(yīng)速率的考察中，除了4 ℃之外，在其他3個(gè)溫度下，反應(yīng)30 min后產(chǎn)物生成率均可達(dá)到60%以上，在4 ℃條件下，反應(yīng)30 min后產(chǎn)物生成率均可達(dá)到40%以上。在反應(yīng)24 h后，37 ℃最終反應(yīng)效率最高，達(dá)到85.1%。

4 討 論

內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域是一個(gè)非常強(qiáng)大的工具，特別是在蛋白質(zhì)連接領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用。但是天然斷裂型內(nèi)含肽對(duì)C末端外顯肽的識(shí)別十分保守，使得在蛋白質(zhì)連接的過程中引入外源氨基酸，導(dǎo)致重組蛋白潛在的免疫原性增加，從而降低了重組蛋白的質(zhì)量。因此，拓展斷裂內(nèi)含肽對(duì)C端外顯肽的寬泛性，使其能夠識(shí)別抗體鉸鏈區(qū)中的CDK等氨基酸序列十分必要。

A:Splicing product formation with specified NaCl concentration；B:Splicing product formation with specified DTT concentration；C:Splicing product formation with specified pH

Figure7 Reaction kinetic curves under different temperature conditions between CH1-NpuN(N) andNpuC*GEP-eGFP

本研究構(gòu)建了NpuC*GEP突變體，探究?jī)?nèi)含肽的底物寬泛性以及首次探究C端外顯肽前3位作用。結(jié)果表明在C末端前3位氨基酸為“CDK”時(shí)，NpuC*GEP突變體成功發(fā)生了剪接反應(yīng)。接下來，本研究對(duì)影響斷裂內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的因素進(jìn)行考察。由結(jié)果可以看出考察的不同的NaCl濃度斷裂內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的影響，除NaCl濃度為0 mmol/L時(shí)產(chǎn)物生成率較高之外，在不同NaCl濃度下產(chǎn)物生成率并無太大區(qū)別。同樣的，在不同pH和DTT濃度下進(jìn)行斷裂內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)，產(chǎn)物生成率的區(qū)別也不大。在對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察中，在反應(yīng)溫度為25 ℃、30 ℃和37 ℃的條件下反應(yīng)24 h后，產(chǎn)物生成率均可達(dá)85%以上。對(duì)上述各種因素的考察體現(xiàn)出本技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)，即在所考察的范圍內(nèi)斷裂內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)均可很好的進(jìn)行反應(yīng)，說明本研究構(gòu)建的突變型斷裂內(nèi)含肽的適用的剪接反應(yīng)條件寬泛，而這些條件都是在雙特異性抗體裝配中可能采用的，因此本平臺(tái)可以很好的為后續(xù)雙特異性抗體的裝配提供技術(shù)支持。同時(shí)，本課題仍有許多方面可以進(jìn)行更為深入的研究，例如在斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的雙特異性抗體裝配平臺(tái)中，可以進(jìn)一步探索內(nèi)含肽N端融合蛋白和C端融合蛋白進(jìn)行剪接反應(yīng)時(shí)加入的摩爾比，加入還原劑類型的篩選以及用量等等?？傊疚臑殡p特異性抗體的開發(fā)提供了新的思路，為生物制藥的工藝開發(fā)提供了有力的技術(shù)支持。