潘詩(shī)苑，鄒巧根，韓 茉，高倩倩

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

咪達(dá)那新(imidafenacin)是一種新型的二苯基丁酰胺類毒蕈堿M1/M3受體阻斷劑，用于治療膀胱過度活動(dòng)癥(overactive active bladder,OAB)[1-2]。它能選擇性作用于膀胱毒蕈堿M1和M3受體，阻斷乙酰膽堿對(duì)逼尿肌的收縮作用，令逼尿肌松弛，可顯著改善膀胱過度活動(dòng)癥所引起的尿急、尿頻、尿失禁等癥狀[1]。膀胱過度活動(dòng)癥是常見的泌尿外科疾病，并以排尿障礙為臨床特點(diǎn)，以尿頻、尿急、急迫性尿失禁等為主的臨床癥候群，其發(fā)生率隨年齡的增長(zhǎng)而升高，因此越來越受到人們的重視。咪達(dá)那新可以通過拮抗毒蕈堿M1受體抑制乙酰膽堿釋放，拮抗毒蕈堿M3受體抑制膀胱平滑肌收縮可有效改善OAB引起的排尿障礙等癥狀[2]。咪達(dá)那新對(duì)膀胱的選擇性強(qiáng)于唾液腺，對(duì)于腦組織中膽堿受體親和力較低，因此中樞和外周不良反應(yīng)較少[4-10]。咪達(dá)那新的血藥濃度較低，對(duì)于其在人體內(nèi)藥物濃度的分析及生物等效性研究國(guó)內(nèi)暫無文獻(xiàn)報(bào)道，在國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道中均采用蛋白沉淀的前處理方法，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用該方法處理樣品時(shí)，化合物響應(yīng)低且峰形差，且有較多血漿內(nèi)源性基質(zhì)雜峰對(duì)化合物峰產(chǎn)生較大干擾，無法準(zhǔn)確定量[11-14]。因此，本試驗(yàn)采用液液萃取的前處理方法去除較多極性化合物的干擾，并采用梯度洗脫的方式降低非極性化合物對(duì)檢測(cè)的影響，使該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高。本試驗(yàn)還將該分析方法成功用于咪達(dá)那新臨床24例樣本量的人體生物等效性試驗(yàn)，為咪達(dá)那新片的生物等效性研究提供了可靠的分析方法。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

受試制劑：咪達(dá)那新片(南京制藥廠有限公司，規(guī)格：0.1 mg,批號(hào)：20180861)；參比制劑：咪達(dá)那新片(URITOS?杏林制藥株式會(huì)社，規(guī)格：0.1 mg，批號(hào)：X013)；咪達(dá)那新(批號(hào)：1418-068A1，含量98.7%)及咪達(dá)那新-d10對(duì)照品(批號(hào)：3185-048A2，含量98.0%，TLC Pharmaceutical Standards公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司)；水為試驗(yàn)室制備超純水，其他試劑均為市售色譜純。

1.2 儀 器

Shimadzu LC-30 A系列UPLC液相色譜聯(lián)合AB Sciex API5500質(zhì)譜聯(lián)用儀：含脫氣機(jī)、雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器以及Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件；XP6百萬分之一微量天平系統(tǒng)(Mettler Toledo公司)；Heraeus Multifuge X1R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；LPD2500多管混合器(萊普特科學(xué)儀器有限公司)；KQ3200DE超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水儀(Merck Millipore公司)；Organomation Microvap 11803氮吹儀(萊普特科學(xué)儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；保護(hù)柱為Waters,Acquity UPLC BEH C8(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%乙酸)，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；選用梯度洗脫模式見表1，化合物在等度條件出峰，初始比例用于洗脫非極性內(nèi)源性物質(zhì)并控制化合物保留時(shí)間。

Table1 Elution gradient of mobile phase

t/minA/%B/%030700.530700.640601.840602.09553.09553.230704.33070

A:2 mmol/L ammonium acetate solution with 0.2% acetic acid;B:Acetonitrile

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源(ESI)；正離子模式檢測(cè)；源噴射電壓為1 500 V；溫度為600 ℃；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，咪達(dá)那新和咪達(dá)那新-d10的檢測(cè)離子分別為m/z320.2→238.1和m/z330.2→248.2。去簇電壓(DP)均為80 V，碰撞能量(CE)分別為24和26 eV。咪達(dá)那新及其內(nèi)標(biāo)子離子色譜圖見圖1。

Figure1 Product ion mass spectra of imidafenacin(A)and imidafenacin-d10(B)

2.2 溶液的配制

精密稱取咪達(dá)那新及咪達(dá)那新-d10對(duì)照品用50%甲醇-水溶液溶解制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL咪達(dá)那新儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用50%甲醇-水將咪達(dá)那新儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為2 000，200，20.0，18.0，10.0，5.0，2.0，1.0，0.4，0.2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。用50%甲醇-水將咪達(dá)那新-d10儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為1.00 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 臨床給藥試驗(yàn)設(shè)計(jì)

受試者給藥前一晚禁食過夜，于給藥前60 min采集空白血樣4 mL。給予受試制劑或參比制劑(咪達(dá)那新1片，每片0.1 mg)以溫開水240 mL送服，并于給藥后0.33，0.67，1，1.25，1.5，1.75，2，2.5，3，4，5，6，8，12，24 h采集靜脈血4 mL。間隔7 d的清洗期后進(jìn)行第2周期試驗(yàn)，兩組受試者服用的藥品交叉，其余步驟同第一周期試驗(yàn)。試驗(yàn)所有受試者簽署知情同意書。

2.4 樣品的處理

2.4.1 全血樣品處理 將經(jīng)肝素鈉抗凝后的全血在采血完成后1 h內(nèi)于4 ℃、 4 000 r/min離心5 min 后取上清液裝入1.5 mL離心并管中在低于-60 ℃條件下凍存。

2.4.2 血漿樣品處理 向96孔板中加入血漿樣品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL(1.00 ng/mL咪達(dá)那新-d10溶液)，加入乙酸乙酯450 μL，1 600 r/min渦旋振蕩10 min后在4 ℃條件下以4 000 r/min速度離心10 min。后取上清液200 μL氮?dú)饬魇覝叵麓蹈珊笥?0%甲醇-水100 μL復(fù)溶后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)確證

3.1.1 方法專屬性 在上述液質(zhì)條件下，取6個(gè)不同來源空白血漿(來源于中國(guó)健康志愿者，采于東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)按上述“2.4.2”樣品處理過程處理后進(jìn)樣，空白血漿樣品色譜圖見圖2，結(jié)果表明血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無干擾?？瞻籽獫{中添加咪達(dá)那新與其氘代內(nèi)標(biāo)后，其保留時(shí)間均為1.15 min，峰形良好?？瞻籽獫{中加入咪達(dá)那新及內(nèi)標(biāo)色譜圖見圖3。

Figure2 Chromatogram of the blank plasma

Figure3 Chromatogram of the blank plasma spiked with imidafenacin and imidafenacin-d10

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在空白基質(zhì)285 μL中分別加入不同質(zhì)量濃度的咪達(dá)那新標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液15 μL，依上述“2.4.2”項(xiàng)下方法處理樣品后進(jìn)樣分析，以化合物及內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，咪達(dá)那新質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，采用加權(quán)(ω=1/x2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸得到回歸方程為Y=0.002 19X+0.001 45，r=0.999 2。結(jié)果表明，咪達(dá)那新在10.0～1 000 pg/mL范圍內(nèi)線性良好。

3.1.3 精密度及準(zhǔn)確度 制備含咪達(dá)那新質(zhì)量濃度分別為30.0、150、750 pg/mL的質(zhì)控樣品按上述“2.4.2”前處理步驟操作后進(jìn)樣分析。分別于1 d內(nèi)測(cè)定6次及連續(xù)3 d進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2 。所有質(zhì)控樣品日間及日內(nèi)精密度RSD均不超過15%。

Table2 Precision and accuracy of the UPLC-MS/MS for the determination of imidafenacin (n=6)

c/(pg/mL)Precision(RSD)/%IntradayInterdayAccuracy(RE)/%IntradayInterday30.02.02.78.5-1.61501.01.67.3-2.07503.81.73.6-2.4

3.1.4 提取回收率 配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平的質(zhì)控樣品，含咪達(dá)那新質(zhì)量濃度分別為30.0，150，750 pg/mL，每個(gè)濃度水平各配制6個(gè)重復(fù)，按上述“2.4.2”樣品前處理步驟操作后進(jìn)樣分析。配制含空白血漿樣品提取液的化合物溶液使其濃度與質(zhì)控樣品進(jìn)樣濃度相同。比較兩者峰面積比來評(píng)價(jià)化合物的提取回收率。提取回收率結(jié)果見表3,3種質(zhì)量濃度的提取回收率分別為84.0%、88.0%和90.0%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)中咪達(dá)那新提取過程對(duì)真實(shí)結(jié)果影響較小。

c/(pg/mL)Recovery/%IntradayInterdayMatrixeffectAverage/%RSD/%30.084.0±4.963.8105±0.5870.615088.0±7.423.0100±0.7440.775090.0±3.073.8101±0.2660.3

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 分別配制同質(zhì)控樣品進(jìn)樣濃度相同的含空白血漿樣品提取液的化合物溶液及同質(zhì)控樣品進(jìn)樣濃度相同的化合物溶液，進(jìn)樣測(cè)定后以兩者經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的比值來比較咪達(dá)那新的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表3，3種質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為105%、100%和101%，結(jié)果表明空白血漿中沒有內(nèi)源性物質(zhì)干擾咪達(dá)那新的測(cè)定。

3.1.6 穩(wěn)定性 配制低濃度及高濃度質(zhì)控樣品，分別考察其在室溫23.9 h，-20 ℃條件凍融3次，-80 ℃條件凍融3次，及分別在-20 ℃、-80 ℃條件30 d長(zhǎng)期放置，儀器進(jìn)樣盤中放置74 h的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4，結(jié)果表明咪達(dá)那新血漿樣品在室溫、進(jìn)樣盤、冷凍保存、反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性良好。方法驗(yàn)證結(jié)果表明，本定量方法靈敏、準(zhǔn)確，適合咪達(dá)那新的臨床血藥濃度測(cè)定。

c/(pg/mL)Testconcentration/(pg/mL)Roomtemperature(23.9h)Freeze-thawcycle(-20°C)Freeze-thawcycle(-80°C)Longtermstability(-20°C)Longtermstability(-80°C)Injectorstability(74h)30.030.0±1.2731.1±0.87029.8±1.1428.8±1.0930.4±0.83028.7±1.91750743±32.9754±4.51761±7.97747±21.0756±16.1739±35.7

3.2 血漿樣品測(cè)定

按照上述“2.4.2”方法處理24名志愿者兩個(gè)周期的血漿樣品進(jìn)樣分析，計(jì)算咪達(dá)那新濃度，用DAS 3.2.8軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并計(jì)算受試制劑和參比制劑中咪達(dá)那新的AUC0-t、AUC0-∞及cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，然后用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和計(jì)算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法來評(píng)價(jià)參比制劑和受試制劑的人體生物等效性。試驗(yàn)結(jié)果見表5，cmax、AUC0-t、AUC0-∞比值的90%置信區(qū)間在80%～125%范圍內(nèi)，不同制劑間無顯著性差異?？纱_定兩制劑在空腹條件下符合生物等效性要求，判定為生物等效。cmax附近人血漿樣本色譜圖見圖4，本試驗(yàn)的C-T均數(shù)曲線見圖5。

Groupcmax/(pg/mL)AUC0-∞/(pg·h/mL)AUC0-t/(pg·h/mL)tmax/ht1/2/hReference524.8±104.62229±553.42097±557.31.250±0.6553.331±0.833Acceptance612.6±132.92466±644.32343±671.31.063±0.3483.125±0.52090%CI1.079-1.2471.053-1.1531.062-1.160--

Figure4 Chromatogram for the test sample of human plasma from healthy Chinese volunteers adminstrated by imidafenacin or reference

4 討 論

在考察色譜條件時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)在有機(jī)相使用乙腈、水相使用2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%乙酸)時(shí)，咪達(dá)那新與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)較高，峰形更好。

在使用等梯度洗脫測(cè)定樣品時(shí)[13]，化合物峰和內(nèi)標(biāo)峰響應(yīng)較低且有較多血漿內(nèi)源性物質(zhì)的雜峰出現(xiàn)，因此采用梯度洗脫的方式，在進(jìn)樣后0.5 min內(nèi)用高比例有機(jī)相洗脫出非極性內(nèi)源性化合物并控制保留時(shí)間在1.15 min左右，適用于大批量生物樣品分析。

咪達(dá)那新在人體中血藥濃度較低，其峰形及響應(yīng)易受血漿中內(nèi)源性基質(zhì)干擾，本試驗(yàn)采用液液萃取的前處理方法，排除較多極性化合物的干擾，使該檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)影響小，色譜柱損耗小。

該方法線性濃度較低，最低定量限達(dá)到10 pg/mL，可配制低濃度儲(chǔ)備液來防止在標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制上產(chǎn)生較大誤差。

本研究建立了UPLC-MS/MS測(cè)定人血漿中咪達(dá)那新濃度的方法，并應(yīng)用于人體生物等效性試驗(yàn)。相較于文獻(xiàn)中的蛋白沉淀前處理方法及線性范圍[11-14]，本方法采用液液萃取前處理方法，線性范圍為10.0～1 000 pg/mL，具有定量下限低、靈敏度高、選擇性好、基質(zhì)效應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[15-16]，滿足咪達(dá)那新體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的檢測(cè)需要。

在試驗(yàn)過程中，受試者均未發(fā)生臨床意義的藥物不良反應(yīng)。受試制劑與參比制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的[2]基本一致。在空腹條件下，試驗(yàn)制劑與參比制劑生物等效。本試驗(yàn)為咪達(dá)那新片的生物等效性研究提供了一種可靠的分析方法。