李君彥，范氏英，孫中宣，程雪翔，葉文才,汪 豪*

(1中國藥科大學(xué)中藥制藥系，南京 210009；2湖北鳳凰白云山藥業(yè)有限公司，麻城 438300；3暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣州 510632)

菊花為菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序。味甘、苦，微寒，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒之功效，可用于目赤腫痛、眼目昏花、風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈等癥。菊花藥材按照產(chǎn)地和加工方法的不同，分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”和“懷菊”等5種[1]。福白菊(Chrysanthemummorifolium‘Fubaiju’)主要產(chǎn)自我國湖北省麻城市，種植規(guī)模3萬畝以上，是我國三大主要白菊品種之一，為湖北省重要道地藥材[2]。菊花主要化學(xué)成分為黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和氨基酸等。藥理研究表明，菊花中黃酮類化合物具有調(diào)血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，酚酸類化合物具有抑菌等藥效活性[3]。目前，福白菊化學(xué)成分及質(zhì)量研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，曾報(bào)道福白菊揮發(fā)油成分的定性分析[4]?！吨腥A人民共和國藥典》中菊花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載綠原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡?；鼘幩岬?個(gè)指標(biāo)成分含量測定項(xiàng)[1]。因此，本文擬采用LC-MSn技術(shù)對福白菊醇提物化學(xué)成分進(jìn)行定性分析；并采用HPLC-UV法，同一色譜條件下測定福白菊中5種化學(xué)成分含量，包括：綠原酸(1)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(3)、3,5-二咖啡酰基奎寧酸(4)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5)(結(jié)構(gòu)式見圖1)，以期快速、準(zhǔn)確地定性、定量分析福白菊中的主要化學(xué)成分，為福白菊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究奠定研究基礎(chǔ)。

Figure1 Structures of the five major constituents fromChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

1 材 料

1.1 藥材與試劑

福白菊藥材主要采集于湖北省麻城市等地，產(chǎn)地及批號見表1，經(jīng)中國藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定為福白菊(Chrysanthemummorifolium‘Fubaiju’)。實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩?、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、4,5-二咖啡酰基奎寧酸均來源于中國食品藥品檢定研究院，純度大于98.0%，結(jié)構(gòu)式見圖1。HPLC用乙腈和甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

Table1 Origin and batch number ofChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

SampleNo.OriginBatchNo.1Macheng,Hubeiprovince1611252Macheng,Hubeiprovince1710023Macheng,Hubeiprovince1605024Macheng,Hubeiprovince161125B5Macheng,Hubeiprovince161125B26Xianyangyan,Hubeiprovince181106A27Xianyangyan,Hubeiprovince181107A38Xianyangyan,Hubeiprovince181105A49Linjiawan,Hubeiprovince181108B310Xianyangyan,Hubeiprovince181119A4

1.2 儀 器

液相色譜儀(含LC-20AT四元泵、SIL-20A HT自動進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M20A型檢測器)，AUW120D型電子天平(日本島津公司);6520 Accurate-Mass Q-TOF液質(zhì)儀，1200高效液相色譜儀，MassHunter B.04.00定性分析軟件(美國安捷倫公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS定性分析

2.1.1 樣品制備

對照品溶液的制備 分別取綠原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡酰基奎寧酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和4,5-二咖啡?；鼘幩釋φ掌愤m量，精密稱定，加70%甲醇溶解，制成混合對照品溶液，濾過，即得。

供試品溶液的制備 取福白菊粉末(過一號篩，批號：161125)約25 mg，精密稱定，加 50%甲醇10 mL，超聲提取60 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.1.2 HPLC條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150 mm×2.0 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～10 min，B：15%～22%；10～15 min，B：22%～23%；15～20 min，B：23%；20～35 min，B：23%～30%。流速：0.3 mL /min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.3 MS條件 離子源為ESI，負(fù)離子模式，霧化氣為氮?dú)?。去溶劑氣體溫度:325 ℃，去溶劑氣體流速:8 mL/min，噴霧器壓力:40 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛細(xì)管電壓:4 000 V，碎裂電壓:100 V，碰撞能量:30 V，質(zhì)譜檢測范圍:MS:m/z100～1 000；MS/MS:m/z100～800。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件對福白菊樣品溶液進(jìn)行MS分析，負(fù)離子模式下總離子流圖見圖2。有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物通過與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間以及質(zhì)譜裂解碎片進(jìn)行確認(rèn)；沒有標(biāo)準(zhǔn)品的未知成分，根據(jù)色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解碎片、紫外吸收并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行確認(rèn)，共鑒定了22個(gè)化合物，見表2。

Figure2 Negative total ion chromatogram ofChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

Table2Identification of chemical consitituents ofChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

PeakNo.CompoundtR/minMolecular formula Calculated/(m/z)[M-H]-/(m/z)Production/(m/z)λmax/nm1Caffeicacid1.421C9H8O4180.1582179.05571352442Chlorogenicacid3.176C16H18O9354.0972353.0951191,179244,300sh,32635-Sinapoylquinicacid3.985C18H22O10398.1733397.1669223,19132641,3-Di-caffeoylquinicacid5.099C25H24O12516.1268515.1239353,191,179,173,135244,300sh,3265Luteolin-7-O-rutinoside9.586C27H30O15594.1583593.1512285268,3486Eriodictyol-7-O-glucoside9.721C21H22O11450.1162449.1102287,151286,3447Luteolin-7-O-glucoside10.599C21H20O11448.1006447.0961285200,227,256,268,3488Luteolin-7-O-glucuronide11.240C21H18O12462.0798461.0725285256,268,3489Luteolinglucoside12.083C21H20O11448.1006447.0957285Weak103,4-Di-caffeoylquinicacid12.353C25H24O12516.1268515.1192353,191,179,173,135244,300sh,32611Apigenin-7-O-rutinoside12.690C27H30O14577.1636577.1583269268,332121,4-Di-caffeoylquinicacid12.960C25H24O12516.1268515.1216353,191,179,173,135244,300sh,330131,5-Di-caffeoylquinicacid13.061C25H24O12516.1268515.1214353,191,179,173,135244,300sh,330

(Continued)

PeakNo.CompoundtR/minMolecular formula Calculated/(m/z)[M-H]-/(m/z)Production/(m/z)λmax/nm143,5-Di-caffeoylquinicacid13.131C25H24O12516.1268515.1213353,191,179,173,135244,300sh,33015Apigenin-7-O-glucoside13.905C21H20O10432.1056431.1003269268,33216Diosmetin-7-O-rutinoside14.074C28H32O15608.5582607.1691299254,268,348174,5-Di-caffeoylquinicacid15.052C25H24O12516.1297515.1225353,191,179,173,135244,300sh,33018Diosmetin-7-O-glucuronide16.267C22H20O12476.0955475.0898299254,268,34819Apigenin-7-O-6″-malonylglucoside17.144C24H22O13518.4200517.1906269Weak20Luteolin-7-O-6″-acetylglucoside20.147C23H22O12490.1111489.1062285Weak21Apigenin-7-O-6″-acetylglucoside27.941C23H22O11474.1162473.1101269Weak22Acacetin-7-O-glucuronide29.763C22H20O11460.1006459.0954283Weak

峰7、8、15與混合對照品質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，分別為luteolin-7-O-glucoside、luteolin-7-O-glucuronide、apigenin-7-O-glucoside。

峰5、峰9和峰20與峰7具有相似的裂解過程，均產(chǎn)生m/z285的碎片離子，推斷其均為luteolin類衍生物。根據(jù)其準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合保留時(shí)間和紫外最大吸收波長及與文獻(xiàn)[5]對比，峰9與峰7具有相同的分子離子峰m/z447[M-H]-和碎片m/z285[M-H-Glucose]-，但其保留時(shí)間約滯后1.5 min，故推測其為luteolin glucoside，糖基連接位置無法確定；峰5具有m/z593[M-H]-，比luteolin-7-O-glucoside的分子離子峰大92，故推斷其為luteolin-7-O-rutinoside；峰20的分子離子峰m/z489[M-H]-比luteolin-7-O-glucoside的分子離子峰大42，推斷其為luteolin-7-O-glucoside的乙?；苌铮疏b定為luteolin-7-O-6″-acetylglucoside。

峰6在ESI-模式下得到m/z449[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z287[M-H-Glucose]-，且在286和344 nm處有最大吸收，結(jié)合保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[5]對比，鑒定其為eriodictyol-7-O-glucoside。

峰11、峰19和峰21與峰15具有相似的裂解途徑，二級質(zhì)譜均得到m/z269的碎片離子。峰11在ESI-模式下得到m/z577[M-H]-，比apigenin-7-O-glucoside的分子離子峰大92，其二級質(zhì)譜得到m/z269[M-H-Glucose]-，且在268 nm和332 nm處有最大吸收，結(jié)合保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[5]對比，鑒定其為apigenin-7-O-rutinoside；峰19的分子離子峰m/z517[M-H]-比apigenin-7-O-glucoside的分子離子峰大86，推斷其為apigenin-7-O-glucoside的丙二酸單?；苌铮Y(jié)合其保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[6]對比，故鑒定為apigenin-7-O-6″-malonylglucoside；峰21的分子離子峰m/z473[M-H]-比apigenin-7-O-glucoside的分子離子峰大42，結(jié)合其保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[5]對比，推斷其為apigenin-7-O-glucoside的乙酰基衍生物，故鑒定為apigenin-7-O-6″-acetylglucoside。

峰16在ESI-模式下可得到m/z607[M-H]-，二級質(zhì)譜得到m/z299[M-H-Rutinose]-，結(jié)合保留時(shí)間和紫外最大吸收波長及與文獻(xiàn)[5]對比，推斷其為diosmetin-7-O-rutinoside。峰18在ESI-模式下可得到m/z475[M-H]-，二級質(zhì)譜得到m/z 299[M-H-Glucuronide]-，結(jié)合保留時(shí)間和紫外最大吸收波長及與文獻(xiàn)[5]對比，推斷其為diosmetin-7-O-glucuronide。

峰22在ESI-模式下可得到m/z459[M-H]-，二級質(zhì)譜得到m/z283[M-H-Glucuronide]-，結(jié)合保留時(shí)間和紫外最大吸收波長及與文獻(xiàn)[5]對比，推斷其為acacetin-7-O-glucuronide。

峰2、峰14、峰17峰與混合對照品質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，分別為chlorogenic acid、3,5-di-caffeoylquinic acid、4,5-di-caffeoylquinic acid。

峰1在ESI-模式下得到m/z179[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z135[M-H-CO2]-，且在244 nm處有最大吸收，結(jié)合保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[5]對比，鑒定其為caffeic acid。

峰3在ESI-模式下得到m/z 397[M-H]-，具有碎片離子m/z223[sinapoyl-H]-，且在326 nm 處有最大吸收，結(jié)合保留時(shí)間及與文獻(xiàn)[5,7]對比，鑒定其為5-sinapoylquinic acid。

峰4、峰10、峰12和峰13在ESI-模式下均得到m/z515[M-H]-，且均可得到多級碎片m/z353[M-H-Caffeoyl]-、m/z191[M-H-2Caffeoyl]-、m/z179[Caffeic acid-H]-、m/z173[Quinic acid-H-H2O]-、m/z135[Caffeic acid-H-CO2]-，根據(jù)化合物出峰順序不同，結(jié)合文獻(xiàn)[5-6,8]，推斷峰4為1,3-di-caffeoylquinic acid，峰10為3,4-di-caffeoylquinic acid，峰12為1,4-di-caffeoylquinic acid，峰13為1,5-di-caffeoylquinic acid。

2.2 HPLC-UV含量測定

2.2.1 HPLC-UV溶液的制備

對照品溶液的制備 分別取綠原酸(1)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(3)、3,5-二咖啡酰基奎寧酸(4)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5)對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每毫升含綠原酸30.0 μg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷39.6 μg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷29.8 μg、3,5-二咖啡?；鼘幩?0.4 μg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷50.0 μg的混合對照品溶液，濾過，即得。

供試品溶液的制備 取福白菊藥材粉末(過一號篩)約0.25 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取40 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相A：0.1%磷酸溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0 min～11 min，B：10%～18%；11 min～30 min，B：18%～20%；30 min～40 min，B：20%。流速為1.0 mL/min，檢測波長為348 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)以3,5-二咖啡?；鼘幩岱逵?jì)算不低于8 000，且5種化合物均能達(dá)到基線分離。供試品溶液及混合對照品溶液HPLC色譜圖見圖3，供試品溶液中5種化合物分離度如表3所示。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系 分別吸取混合對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0，40.0 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果如表4所示，5種對照品在對應(yīng)線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 9，呈良好線性。

Figure3 (A) HPLC chromatogram ofChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’ (batch No.161125);(B) HPLC chromatogram of reference substances

1:Chlorogenic acid;2:Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside;3:Luteolin-7-O-β-D-glucopyranuronide;4:3,5-Di-caffeoylquinic acid;5:Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside

Table3 Resolution of the five major constituents fromChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

Compd.tR/minPeakareaResolution113.1485706171.393226.75414017931.673328.31314236111.535434.03420430773.101536.32126151543.231

Table4 Calibration curves of the five major constituents fromChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’

Compd.Linearrange/μgLinearequationrLOQ/ngLOD/ng10.03000-1.200Y=51624X+134680.99992.40.720.03960-1.584Y=116169X-219941.0003.21.630.02980-1.192Y=88790X-554180.99999.52.440.06040-2.416Y=132066X-293271.0009.74.350.05000-2.000Y=148256X-265911.0004.01.2

定量限(LOQ)和檢測限(LOD) 取以上混合對照品溶液，用70%甲醇逐步稀釋后進(jìn)樣分析，取(S/N≥10)和(S/N≥3)信噪比時(shí)的進(jìn)樣量分別為定量限和檢測限。結(jié)果如表4 所示，綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩帷⑶鄄怂?7-O-β-D-葡萄糖苷的定量限(S/N≥10)分別為2.4、3.2、9.5、9.7、4.0 ng，檢測限(S/N≥3)分別為0.7、1.6、2.4、4.3、1.2 ng。

精密度 精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩?、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積RSD分別為0.11%、0.20%、1.00%、1.71%、1.70%，表明本法精密度較好。

重復(fù)性 取同一批福白菊(批號：161125)粉末6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照上述色譜條件檢測。結(jié)果顯示，綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡酰基奎寧酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量(%)分別為0.34、0.64、0.48、1.04和1.23，RSD(%)分別為0.72、0.19、1.49、0.85和0.77。結(jié)果表明，本法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性 精密量取同一供試品溶液(批號：161125)10 μL，4 ℃保存，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩帷⑶鄄怂?7-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積。結(jié)果顯示，上述5種成分峰面積的RSD(%，n=6)分別為0.93、0.36、0.52、0.75和1.36，表明供試品溶液在4℃放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收率 取已準(zhǔn)確測定含量的福白菊(批號：161125)粉末0.25 g，共9份，精密稱定，分別加入高、中、低濃度的對照品適量，每個(gè)濃度設(shè)置3份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測，按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩?、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的加樣回收率和RSD。結(jié)果顯示，5種成分的加樣回收率(%)分別為103.16、100.99、101.14、99.41和98.72，RSD(%)分別為0.66、0.79、1.07、1.31和1.18，均符合規(guī)定。

2.2.4 樣品測定 收集10批福白菊藥材(產(chǎn)地、批號等信息見表1)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行樣品測定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸(1)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(3)、3,5-二咖啡酰基奎寧酸(4)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5)含量。結(jié)果見表5。

Table5 Contents determination ofChrysanthemummorifolium‘Fubaiju’ samples

BatchNo.Content/%123451611250.320.630.460.971.231710020.480.440.651.270.511605020.300.410.520.880.68161125B0.290.480.410.820.81161125B20.300.440.450.890.80181106A20.500.550.561.150.62181107A30.480.530.521.100.59181105A40.510.530.591.190.58181108B30.650.510.651.340.60181119A40.320.260.300.700.29

1:Chlorogenic acid;2:Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside;3:Luteolin-7-O-β-D-glucopyranuronide;4:3,5-Di-caffeoylquinic acid;5:Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside

3 討 論

本研究采用LC-MSn法進(jìn)行福白菊主要化學(xué)成分定性分析，建立HPLC-UV法同一色譜條件下5個(gè)指標(biāo)成分含量測定方法并進(jìn)行方法學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)分別考察了檢測波長、柱溫和流動相種類，化合物1和4的最大吸收波長為327 nm，化合物2、3和5的最大吸收波長約在348 nm，參考《中華人民共和國藥典》菊花藥材含量測定的色譜條件，確定檢測波長為348 nm;LC-MSn法進(jìn)行定性分析時(shí)，流動相加入甲酸可改善色譜峰拖尾現(xiàn)象，離子化信息較為豐富；HPLC-UV法進(jìn)行主要化合物的含量測定時(shí)，流動相選擇為乙腈-0.1%磷酸水溶液，各成分分離效果良好。

本實(shí)驗(yàn)為首次對福白菊醇提物的化學(xué)成分進(jìn)行LC-MSn定性分析，通過對照品保留時(shí)間、碎片離子比對，及未知色譜峰的精確分子質(zhì)量、裂解碎片等質(zhì)譜信息分析，共鑒定出22個(gè)化學(xué)成分，包括13個(gè)黃酮類成分和9個(gè)酚酸類成分。采用HPLC-UV法同時(shí)測定福白菊中綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,5-二咖啡?；鼘幩岷颓鄄怂?7-O-β-D-葡萄糖苷5種主要成分的含量，10批福白菊藥材中上述5種成分的含量分別為0.29%～0.65%、0.26%～0.63%、0.30%～0.65%、0.70%～1.34%、0.29%～1.23%，均符合《中華人民共和國藥典》菊花品種的含量要求，其中3,5-二咖啡?；鼘幩?，及芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷為福白菊藥材中含量較高成分。在不同采摘時(shí)間和不同產(chǎn)地的藥材中，各成分含量不盡相同，藥材1～9均為胎菊，藥材10為朵菊，藥材10各成分含量明顯偏低，推測福白菊胎菊有效成分含量較高，品質(zhì)優(yōu)于朵菊。