錢新宇，肖云峰，王玉華，楊秀華，王 娜

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 1藥學(xué)院;2新藥安全評價研究中心,呼和浩特 010010)

在全球范圍內(nèi)，缺血性心臟病(ischemic cardiomyopathy，ICM)的發(fā)病率和病死率不斷增加。缺血性心臟病是指由冠狀動脈粥樣硬化引起的長期心肌缺血，從而導(dǎo)致心肌彌漫性纖維化臨床綜合征。而再灌注治療是目前治療缺血性心臟病最有效的治療策略。然而當(dāng)缺血組織恢復(fù)灌注后，會發(fā)生代謝功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI會影響治療效果，增加惡性心律失常和心臟猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險[1-2]。在MIRI期間，線粒體氧化損傷會增加線粒體氧化應(yīng)激從而加劇心肌損傷。線粒體氧化損傷導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生一系列變化，如線粒體通透性改變，線粒體腫脹和促凋亡蛋白的釋放[3]，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，離子穩(wěn)態(tài)失衡及收縮功能障礙，最終引起心肌細(xì)胞凋亡和壞死。因此，保護線粒體免受氧化損傷可能是改善MIRI的合理方法之一[4]。

肉豆蔻-8散是由肉豆蔻、沉香、丁香、廣棗、木香、旋覆花、阿魏和牦牛心八味蒙藥組成，該方最早被經(jīng)典醫(yī)學(xué)著作《普濟方集》[5]收錄，目前該方被《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》[6]第二冊所收錄。該方應(yīng)用于蒙藥臨床已超過兩百多年，通常用于心煩、氣短、心供血不足、風(fēng)濕性心臟病等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻具有抗心肌缺血[7]和抗氧化作用[8]。因此，肉豆蔻-8散減輕MIRI可能與抑制線粒體氧化損傷有關(guān)。此外，本課題組還用外標(biāo)法測定了肉豆蔻-8散提取物主要成分的含量，其包括丁香酚(10.755 8 mg/g)、去氫木香內(nèi)酯(2.041 8 mg/g)、木香烴內(nèi)酯(1.691 5 mg/g)、鞣花酸(0.690 4 mg/g)和去氫二異丁香酚(0.189 3 mg/g)等。

JAK2/STAT3是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和細(xì)胞功能的重要信號通路，與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)。此外，JAK2/STAT3信號的激活可以減少氧化應(yīng)激[9]并維持線粒體功能[10]。然而，肉豆蔻-8散是否可以通過JAK2/STAT3信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷尚未闡明。因此，本研究旨在探討肉豆蔻-8散對MIRI心臟的保護作用和肉豆蔻-8散對線粒體功能的影響。同時探究這些作用是否與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。

1 材 料

1.1 細(xì)胞及試劑

H9c2心肌細(xì)胞(上海富恒細(xì)胞庫)；肉豆蔻-8散(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院制備)；連二亞硫酸鈉(天津永晟精細(xì)化工有限公司)；CCK-8、細(xì)胞裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)；Hoechst(上海碧云天生物技術(shù)公司)；AG490，β-actin，AG490阻斷劑(純度大于99%)，JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2一抗(英國Abcam公司)；胰蛋白酶、DMSO(北京索萊寶技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；山羊抗兔二抗(美國Abbkine公司)。

1.2 儀 器

倒置式生物顯微鏡(德國Leica公司)；全自動酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾儀器有限公司)；紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；全自動生化分析儀(愛爾蘭Sapphire公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2 方 法

2.1 肉豆蔻-8散及提取物的制備

通過文獻[6]中肉豆蔻-8散處方進行制備，藥材均購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定。選取肉豆蔻、沉香、丁香、廣棗、木香、旋覆花和阿魏各250 g，以及牦牛心150 g，以上八味藥材，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取肉豆蔻-8散10.0 g，精密稱定，置于500 mL圓底燒瓶中，加入75%乙醇250 mL，加熱回流提取30 min，提取2次，合并濾液，蒸干，得到肉豆蔻-8散提取物5 g。稱取一定量的肉豆蔻-8散提取物，首先用DMSO溶解至一定濃度，然后用DMEM稀釋至相應(yīng)濃度么，最后用0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 AG490阻斷劑的制備

稱取AG490阻斷劑2.95 mg，精密稱定，置于棕色玻璃小瓶中，加入DMSO 100 μL，使用渦旋儀將其完全溶解，加入無血清培養(yǎng)液900 μL，配成10 mmol/L AG490阻斷劑。使用0.22 μm微孔濾膜除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組及給藥

實驗共分為6組，空白組使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；模型組使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；AG490阻斷劑組加入終濃度為40 mg/L肉豆蔻-8散提取物及1 mol/L AG490阻斷劑的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；肉豆蔻-8散提取物低劑量組加入終濃度為10 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；肉豆蔻-8散提取物中劑量組加入終濃度為20 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；肉豆蔻-8散提取物高劑量組加入終濃度為40 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞。消化后以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組，完成相應(yīng)處理后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸收度，計算細(xì)胞活力，實驗平行測定3次。

2.5 Hoechst染色法

取生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，消化后以每孔1×105個細(xì)胞接種于24孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組，完成相應(yīng)處理后，每孔加入Hoechst 33342染液250 μL，避光培養(yǎng)30 min，棄去染色液，PBS清洗3次，每次1 min。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.6 生化指標(biāo)的檢測

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、AST 含量的檢測 取生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，消化后以每孔6×105個細(xì)胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組，完成相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。1 000 r/min，離心7 min，吸取上清液。使用全自動生化分析儀進行檢測LDH、CK和AST水平，實驗平行測定6次。

2.6.2 細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px含量的檢測 取生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，消化后以每孔6×105個細(xì)胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組，完成相應(yīng)處理后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用細(xì)胞裂解液收集各組細(xì)胞。BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，進而根據(jù)試劑盒操作說明書測定細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px水平，實驗平行測定3次。

2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)

取生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，消化后以每孔6×105個細(xì)胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組，完成相應(yīng)處理后，使用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量法測定細(xì)胞蛋白濃度，在樣品中加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液使用100 ℃金屬浴加熱10 min進行蛋白變性；按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書進行SDS聚丙烯酰胺凝膠的制備；以80 V，30 min電泳濃縮膠，以120 V，90 min電泳分離膠，當(dāng)指示帶電泳至分離膠底部停止電泳；轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上，使用Western blot封閉液封閉10 min；一抗(β-actin，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3，Bax，Bcl-2，1∶1 000)4 ℃孵育過夜；使用TBST清洗3次，每次10 min，二抗(1∶5 000)搖動孵育1 h；TBST清洗3次，使用紅外激光成像系統(tǒng)進行檢測，Image J軟件獲得灰度，實驗平行測定3次。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立

實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，不同濃度的Na2S2O4均可顯著降低細(xì)胞存活率(P<0.01)，并隨Na2S2O4劑量增大，H9c2心肌細(xì)胞存活率不斷下降，其中Na2S2O4對H9c2細(xì)胞活力的半數(shù)抑制量為2 mmol/L。因此，選擇2 mmol/L Na2S2O4作為心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型。結(jié)果見圖1。

Figure1 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

##P<0.01vscontrol group

3.2 肉豆蔻-8散提取物對Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響

實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度肉豆蔻-8散提取物均可顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.01)，并隨肉豆蔻-8散提取物劑量增大，H9c2心肌細(xì)胞存活率不斷提高。其中，肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)與肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)、高劑量組(40 mg/L)均有顯著差異(P<0.01)；肉豆蔻-8散中劑量組與高劑量組有顯著差異(P<0.05)；AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用，結(jié)果見圖2。

Figure2 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

A:Control；B:Model；C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L)；E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

##P<0.01vsmodel group；*P<0.05，**P<0.01

3.3 肉豆蔻-8散提取物對心肌細(xì)胞形態(tài)改變的影響

Hoechst熒光細(xì)胞核染色，可直接反映細(xì)胞的存活量，其熒光強度可反映細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。結(jié)果見圖3。熒光倒置顯微鏡下觀察，空白組細(xì)胞呈均一核染，且未見核異常，結(jié)果見圖3-A；模型組細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞出現(xiàn)核破裂、細(xì)胞數(shù)量變少及細(xì)胞核呈碎塊狀致密濃染等凋亡形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果見圖3-B；AG490阻斷劑組細(xì)胞狀態(tài)與模型組相似，結(jié)果見圖3-C；肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象減弱，細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，但細(xì)胞間隙較大，結(jié)果見圖3-D；肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象減弱，細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，結(jié)果見圖3-E；肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象明顯減弱，細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，結(jié)果見圖3-F。

3.4 肉豆蔻-8散提取物對生化指標(biāo)檢測結(jié)果的影響

實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度肉豆蔻-8散組細(xì)胞培養(yǎng)液中CK、LDH、AST含量顯著降低(P<0.01)，其中，與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較，肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細(xì)胞培養(yǎng)液中CK、LDH、AST含量顯著降低(P<0.01)；AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用，結(jié)果見表1。

Figure3 Hoechst staining to observe the apoptotic morphology of cardiomyocytes

A:Control；B:Model；C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L)；E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

GroupCK/(U/L)LDH/(U/L)AST/(μmol/L)Control5.64±1.18##27.83±5.26##5.43±0.73##Model9.46±1.2777.37±8.3813.92±0.16AG490blocker9.53±1.54##71.32±5.74##13.62±0.23##Roudoukou-8San(10mg/L)8.48±1.23##64.45±5.78##11.36±0.22##Roudoukou-8San(20mg/L)7.41±1.24##??47.45±4.78##??7.26±0.48##??Roudoukou-8San(40mg/L)6.54±1.04##??36.57±4.42##??6.21±0.36##??

##P<0.01vsmodel group；**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度肉豆蔻-8散組細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.01)，其中，與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較，肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.01)；AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用，結(jié)果見表2。

GroupCAT/(U/mgprot)SOD/(U/mgHb)GSH-Px/(U/mgprot)Control7.67±1.65##309.89±21.28##28.83±5.73##Model2.47±0.25172.34±12.988.42±2.16AG490blocker2.93±0.24171.82±13.758.47±2.27Roudoukou-8San(10mg/L)4.26±0.21##207.35±12.98##15.26±1.98##Roudoukou-8San(20mg/L)5.99±1.01##??233.50±19.49##??20.94±1.39##??Roudoukou-8San(40mg/L)6.56±0.69##??285.26±17.69##??27.23±5.18##??

##P<0.01vsmodel group；**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

3.5 肉豆蔻-8散提取物對心肌細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-JAK2、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度肉豆蔻-8散組可使p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加(P<0.01)、Bax蛋白表達減少(P<0.01)；其中，與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較，肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加(P<0.01)、Bax蛋白表達減少(P<0.01)；AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用，結(jié)果見圖4。

4 討 論

本實驗的結(jié)果顯示，2 mmol/L Na2S2O4可顯著降低細(xì)胞活力，同時可顯著增加LDH、CK和AST的水平，說明本實驗的H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型建立成功。與模型組相比，肉豆蔻-8散提取物可增加受損細(xì)胞的活力、顯著降低LDH、CK和AST的水平。故肉豆蔻-8散可減輕MIRI。MIRI的氧化應(yīng)激增加會造成線粒體氧化損傷，反過來，線粒體氧化損傷又會加劇MIRI。SOD、GSH-Px和CAT是3種重要的抗氧化酶。SOD可阻斷氧自由基對細(xì)胞的損傷，并且能夠及時修復(fù)受損的細(xì)胞。CAT可將H2O2直接分解為H2O和O2，從而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。GSH-Px可維持機體氧化與抗氧化平衡，從而保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)免受過氧化物損傷。實驗結(jié)果說明，肉豆蔻-8散可使心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px和CAT的活性提高，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、修復(fù)受損細(xì)胞。故肉豆蔻-8散可減輕由心肌缺血再灌注損傷造成的氧化損傷，發(fā)揮心臟保護作用。

Figure4 Effect ofRoudoukou-8Sanon the protein expression of JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,Bax and Bcl-2 in cardiomyocytes

1:Control；2Model；3:AG490 blocker;4:Roudoukou-8San(10 mg/L)；5:Roudoukou-8San(20 mg/L);6:Roudoukou-8San(40 mg/L)

##P<0.01vsmodel group；*P<0.05，**P<0.01

在這項研究中，肉豆蔻-8散不僅對心肌細(xì)胞具有保護作用同時也顯著減少模型組p-JAK2和p-STAT3表達，使抗凋亡因子Bcl-2增加和促凋亡因子Bax減少。但這些作用可被JAK2特異性阻斷劑AG490消除。Bcl-2和Bax在MIRI的凋亡過程中起重要作用并且是內(nèi)在線粒體途徑的重要組成部分[11]。之前研究已證明，多種藥物可作用于JAK2/STAT3信號通路，調(diào)節(jié)內(nèi)在線粒體途徑進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-14]。故肉豆蔻-8散激活JAK2/STAT3信號通路可促進心肌細(xì)胞中抗凋亡信號傳導(dǎo)，進而發(fā)揮心肌保護作用。

總之，實驗結(jié)果表明，肉豆蔻-8散可減輕心肌缺血再灌注損傷，對心臟具有保護作用。而這種保護作用主要與JAK2/STAT3信號的激活和線粒體氧化損傷的減輕有關(guān)。肉豆蔻-8散可通過激活JAK2/STAT3信號通路減弱MIRI誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷。這些結(jié)果表明，肉豆蔻-8散可能成為治療心肌缺血再灌注損傷的有效藥物之一。