顧恒，李建香，劉云芳，過偉峰

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046)

腦出血在我國約占全部卒中的20%～30%，急性期病死率和致殘率高，存活患者也大多遺留后遺癥。受限于各地醫(yī)療水平，現(xiàn)代醫(yī)學認為降低腦出血負擔的最佳方法仍以預防高血壓為主[1]。國醫(yī)大師周仲瑛教授在中風痰熱腑實學說基礎上，創(chuàng)新性地提出瘀熱阻竅學說。認為本病系火熱毒邪壅于血分，瘀熱搏結，氣火上沖，迫血上涌，灼傷腦絡；同時因腦中蓄血，郁而化熱，絡熱血瘀，進一步損害腦元。據(jù)此，創(chuàng)制涼血通瘀方治療，功效涼血散瘀、通腑瀉熱。臨床觀察評價涼血通瘀方治療腦出血的臨床療效，經(jīng)168例觀察，總有效率88.0%，優(yōu)于對照組(169例)的77.5%(P<0.05)[2]。

腦出血后腦損傷主要在于原發(fā)性血腫引起的占位效應以及繼發(fā)性病理改變。血腫周圍的缺血水腫區(qū)形成后，腦組織急性氧化應激，生成的超氧陰離子自由基攻擊生物細胞膜大分子，同時引起一系列的炎癥反應。而中性粒細胞浸潤后會產(chǎn)生更多的活性氧，加重氧化損傷。氧化應激和炎癥反應貫穿本病各個階段，是導致神經(jīng)功能缺損的關鍵機制。本實驗旨在從抗氧化和抗炎角度探討涼血通瘀方發(fā)揮神經(jīng)功能保護的作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量250～300 g，合格證號：SCXK(浙)2014-0001。于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)，5只/籠，自由飲水攝食，7:00～19:00光暗交替，恒溫恒濕。

1.2 主要實驗藥物與試劑

涼血通瘀方：生大黃10 g,水牛角30 g,生地黃20 g,赤芍15 g,牡丹皮10 g,石菖蒲10 g。中藥材按常規(guī)方法水煎煮濃縮，每毫升含生藥1.2 g。

Takara SYBR Premix Ex Taq(日本Takara公司)，Takara PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(日本Takara公司)，nNOS、TLR-4、IL-1β引物(上海生工生物工程有限公司)，MDA檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 主要實驗儀器

腦立體定位儀(成都泰盟軟件有限公司)、酶標儀(美國PerkinElmer公司)、注射泵控制器(保定蘭格恒流泵有限公司)、7500 Real Time PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 腦出血模型的建立

大鼠稱體質量編號，喂養(yǎng)一周后參照Xue M[3]自體尾動脈血注入法，制備大鼠腦出血模型，造模后評估神經(jīng)功能缺損程度。選取Longa評分法中1～3分的大鼠作為模型動物。

2.2 動物分組及給藥

大鼠隨機分為以下4組，每組18只，分配至用藥后1 、3 、5 d三個時間點，各時間點6只。

正常組、模型組、假手術組(開顱后插入進樣器針頭但不注血)：予用藥組等體積生理鹽水。

涼血通瘀組：造模后3 h開始灌胃用藥，給藥量均為1 mL/100 mg體質量，每日1次，共5 d。

2.3 行為學評分

采用Longa五級評分法[4]和平衡木測驗[5]，于動物蘇醒后評估神經(jīng)功能缺損癥狀。標準見表1。

表1 腦出血大鼠行為學評分標準

2.4 硫代巴比妥酸反應法檢測腦組織中MDA含量

取腦組織處理后按照MDA試劑盒說明書步驟操作，依次加樣孵育進行顯色反應，將96孔板置入酶標儀檢測吸光值，制作標準曲線，計算腦組織MDA含量。

2.5 RT-PCR法檢測腦組織nNOS、CuZnSOD、TLR-4、IL-1β mRNA的表達

取體積約5×5×5 mm3大小的組織置于平頭管中，放入小鋼珠，按50～100 mg組織/mL Trizol加入Trizol使用球磨儀震蕩擊打裂解細胞，提取總RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度及純度。按照Takara逆轉錄試劑說明書配制反應體系，進行逆轉錄。將逆轉錄后的產(chǎn)物處理后于PCR儀內進行擴增。引物設計如下：nNOS(sense primer：AATGGTGGAGGTGCTGGAGGAG；anti-sense primer: CTGGAGAGGAGCTGATGGAGTAGTAG)；CuZnSOD(sense primer：GCCGTGTGCGTGCTGAAGG；anti-sense primer: TGTAATCTGTCCTGACACCACAACTG)；TLR-4(sense primer：GCTGCCAACATCATCCAGGAAGG；anti-sense primer: TGATGCCAGAGCGGCTACTCAG)；IL-1β(sense primer：CAGCAGCATCTCGACAAGAG；anti-sense primer: AAAGAAGGTGCTTGGGTCCT)；GAPDH(sense primer：AAGGGCTCATGACCACAGTC；anti-sense primer: GGATGCAGGGATGATGTTCT)。PCR反應程序：Stage1(預變性)：Reps：1；95℃ 30 s。Stage2(PCR反應)：Reps：40；95℃ 5 s、60℃ 34 s。以GAPDH為內參，使用2公式計算目的基因相對表達量。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 行為學評分結果

各時間點假手術組行為學評分均為0分。造模各組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，與假手術組比，P均<0.01。用藥3、5 d后，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。各造模組評分隨時間逐漸下降。見表2。

表2 各組大鼠行為學評分分)

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2 氧化應激指標CuZnSOD、nNOS mRNA表達和MDA含量的結果

各時間點模型組腦組織CuZnSOD mRNA表達量均明顯低于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯高于模型組(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織CuZnSOD mRNA表達量

注：與正常組相比，$$P<0.01，$P<0.05；與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

各時間點模型組腦組織nNOS mRNA表達均明顯高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織nNOS mRNA表達量

注：與正常組相比，$$P<0.01；與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比，##P<0.01

各時間點模型組腦組織MDA含量均明顯高于假手術組(P<0.05，P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腦組織MDA含量

注：與正常組相比，$P<0.05，$$P<0.01；與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.3 炎性因子TLR-4、IL-1β mRNA表達結果

用藥1、5 d，模型組腦組織TLR-4 mRNA表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.05)。

用藥1 d，模型組腦組織IL-1β mRNA表達量明顯高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組明顯低于模型組(P<0.01)。用藥5 d，模型組腦組織IL-1β mRNA表達量明顯高于假手術組(P<0.01)。見表6。

表6 各組大鼠腦組織TLR-4、IL-1β mRNA表達量

注：與正常組相比，$$P<0.01，$P<0.05；與假手術組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05

4 討論

超氧化物歧化酶(SOD)能夠利用氧化還原金屬將超氧化物轉化成氧和過氧化氫，過氧化氫又被過氧化氫酶和過氧化物酶立即分解成無害的水，形成機體內天然存在的抗氧化機制[6]。脂質是氧化應激涉及最多的生物靶點，其氧化過程中會產(chǎn)生許多二級產(chǎn)物，這些產(chǎn)物主要是醛類如丙二醛(MDA)等，這些醛類持續(xù)存在且有高反應活性，易于產(chǎn)生高毒性分子，與核酸和蛋白質等生物大分子相互作用，誘導細胞凋亡[7]。神經(jīng)系統(tǒng)調控神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的活化與去活化來調節(jié)一氧化氮(NO)的含量，從而調節(jié)腦部血流。腦出血后血腫周圍會出現(xiàn)不同程度的腦血流量改變，缺血缺氧后引發(fā)的氧化應激反應迅速產(chǎn)生大量NO，過量的NO會成為神經(jīng)毒性物質。同時，NO作為信號分子，能夠啟動全身的炎癥反應，抑制nNOS活性是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要手段。TLR-4是各級炎性信號通路的初始開關，可激活下游NF-κB信號通路釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子如IL-1β可直接或間接參與腦出血炎性反應[8]。IL-1β在繼發(fā)性腦損傷過程中大量分泌，可進一步激活巨噬細胞和星形膠質細胞，破壞血腦屏障通透性，誘導神經(jīng)細胞凋亡，從而又加重腦水腫等繼發(fā)性腦損害，在惡性循環(huán)的腦損傷過程中炎性反應可級聯(lián)放大[9]。路夢茹[10]等研究發(fā)現(xiàn)抑制細胞內TLR-4表達后，可有效阻止TLR-4及下游炎癥因子IL-1β、IL-6等的信號傳遞和表達，從而減輕腦出血炎癥損傷。本實驗通過大鼠的腦出血模型來觀察神經(jīng)功能修復水平，并測定可反映氧化應激和炎癥反應的指標，試從抗氧化和抗炎方面解釋涼血通瘀方對神經(jīng)功能的保護作用。

實驗證明，經(jīng)涼血通瘀方干預后的腦出血大鼠行為學評分明顯降低，神經(jīng)功能缺損情況明顯改善。模型組在各時間點MDA含量和nNOS基因表達增高、CuZnSOD基因表達降低，表明腦出血后氧化應激反應活躍，超氧陰離子清除率降低，損傷血管和細胞功能。模型組造模后第1天和第5天TLR-4、IL-1β基因表達均明顯升高，表明炎癥反應與腦出血息息相關，腦出血后腦損傷激活TLR-4大量表達后激活下游的IL-1β大量表達，損害腦功能。涼血通瘀方對比模型組，在不同時間點明顯降低MDA含量和nNOS、TLR-4、IL-1β基因表達，提高CuZnSOD基因表達，發(fā)揮了抗氧化和抗炎作用。

綜上所述，涼血通瘀方能夠減輕氧化應激和炎癥反應，有效清除氧自由基，抑制炎癥的級聯(lián)放大效應，從而保護腦出血后的神經(jīng)功能。本實驗為名老中醫(yī)的有效驗方的使用提供了現(xiàn)代科學依據(jù)。