褚保鳳,底建輝,方 強(qiáng),常宏宇

(1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 兒科，北京102600；2.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院 泌尿外科，北京102400;3.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院 兒科,北京100088)

再生障礙性貧血(Aplastic Anemia，AA，再障)是多種原因造成造血機(jī)能下降，致中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板減少的一組綜合征[1,2]。再生障礙性貧血在臨床上可表現(xiàn)為骨髓造血功能低下、全血細(xì)胞減少感染綜合征，可發(fā)生于各年齡段，多發(fā)病于小兒[3]。再生障礙性貧血的具體病因還不明確，當(dāng)前有研究認(rèn)為機(jī)體的免疫異常和淋巴因子介導(dǎo)的造血干細(xì)胞過度凋亡可引起骨髓衰竭，且造血干細(xì)胞被大脂肪細(xì)胞所取代，纖維網(wǎng)間僅含少許小淋巴細(xì)胞，纖維粘附顆粒極少，從而促使骨髓造血發(fā)生障礙[4,5]。MRE11(meiotic recombination 11 homologA)是MRN復(fù)合物的主要成員之一，定位于11q21，包括N端的4個(gè)磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，以及2個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可參與同源重組、端粒長度的維持和DNA雙鏈斷裂修復(fù)[6]；特別是當(dāng)DNA損傷時(shí)，維持遺傳信息的穩(wěn)定性，維持染色體的穩(wěn)定性[7]。血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17等可以刺激巨核細(xì)胞的生長和血小板的生成，從而影響巨核細(xì)胞成熟[8]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在維護(hù)機(jī)體免疫平衡中發(fā)揮了重要作用，Th 17Treg細(xì)胞分化主要依賴特異性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子信號[9]。轉(zhuǎn)錄因子RORΥ1是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員；叉頭狀/翅膀狀旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子(Fox head/winged helix transcription factor P3，F(xiàn)oxp3)屬于叉頭蛋白家族，是Treg細(xì)胞最主要的調(diào)控因子，其能維持Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性與免疫低反應(yīng)性[10]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種功能性糖蛋白，也是一種促血管生成因子，其具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生的能力，并能增強(qiáng)毛細(xì)血管的通透性，為多種炎癥性疾病的主要生物活性因子[11]。本文具體探討了血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在兒童再生障礙性貧血免疫發(fā)病的診斷價(jià)值及治療意義，希望為揭示兒童再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床診治提供基礎(chǔ)。現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，采用回顧性研究方法，收集2011年8月到2018年2月在北京市大興區(qū)人民醫(yī)院診治的再生障礙性貧血患兒42例作為觀察組，同期留取42名兒童保健科體檢者外周血作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組患兒都經(jīng)臨床診斷和骨髓病理活檢確診為再生障礙性貧血；對照組患兒排除惡性血液??；年齡1-6歲；臨床與檢測資料完整；標(biāo)本的采集事先均征得家長同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料缺乏者；合并先天性心肝腎異常的患兒；合并其他免疫類疾病的患兒；患有對貧血產(chǎn)生影響的其他疾病的患兒。

觀察組中男22例，女20例；平均年齡4.53±1.11歲；平均體重18.20±2.48 kg；平均身高109.28±10.48 cm；平均病程19.28±2.11個(gè)月；初治32例，復(fù)治10例；平均血小板計(jì)數(shù)為(16.28±10.88)×109/L；平均巨核細(xì)胞數(shù)1.89±0.49個(gè)。

對照組中男21例，女21例；平均年齡4.78±1.09歲；平均體重18.21±3.72 kg；平均身高108.92±9.78 cm；平均血小板計(jì)數(shù)為(186.22±41.87)×109/L；平均巨核細(xì)胞數(shù)0個(gè)。

1.2 MRE11、TPO、IL-17、VEGF檢測

空腹抽取兩組小兒的外周靜脈血1-2 ml，常規(guī)抗凝后低溫3 500 r/min離心20 min(離心半徑10 cm)，留取血漿凍存于-80℃冰箱。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測法檢測MRE11、TPO濃度，試劑盒購自蘇州卡爾文生物有限公司；采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-17、VEGF含量，試劑盒購自蘇州卡爾文生物有限公司。

1.3 Th 17Treg檢測

取1.2中的血液樣本，分離收集外周血單核細(xì)胞，抽提RNA，采用qRT-PCR法檢測Th 17Treg RORΥ1、Foxp3表達(dá)水平，RORΥ1正向引物5′-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC-3′，反向引物5′-AGGAAGTCCATGTGGGAGATGT-3′；Foxp3正向引物5′-CAGCACATTCCCAGAGTTCCTC-3′，反向引物5′-CCCACCACCTCACCGAGGCCA-3′。在PCR中，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火并延伸1 min，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

SPSS22.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和百分率表示，對比為t檢驗(yàn)與卡方(χ2)分析，兩變量相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)，所有P值均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MRE11、TPO、IL-17、VEGF含量對比

觀察組的TPO、IL-17含量高于對照組，MRE11、VEGF含量低于對照組，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組MRE11、TPO、IL-17、VEGF含量對比(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2 Th 17Treg表達(dá)水平對比

觀察組的Th 17Treg細(xì)胞中的RORΥ1表達(dá)水平高于對照組，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平低于對照組，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組Th 17Treg表達(dá)水平對比(×10-3，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 相關(guān)性分析

在觀察組患兒中，直線相關(guān)性分析顯示Th 17Treg細(xì)胞中的RORΥ1表達(dá)水平與TPO、IL-17、血小板計(jì)數(shù)、巨核細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)性(P<0.05)，與MRE11、VEGF含量呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；Foxp3表達(dá)水平水平與TPO、IL-17、血小板計(jì)數(shù)、巨核細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與MRE11、VEGF含量呈正相關(guān)性(P<0.05)。見表3與圖1。

表3 兒童再生障礙性貧血免疫發(fā)病Th 17Treg細(xì)胞表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)性(n=42)

圖1 兒童再生障礙性貧血免疫發(fā)病Th 17Treg細(xì)胞表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)性

3 討論

再生障礙性貧血是一種骨髓造血功能嚴(yán)重衰竭的疾病，臨床上對患者的識別率低、誤診率高，臨床病程差異較大，預(yù)后一般比較差，主要與病情的嚴(yán)重程度和全血細(xì)胞減少持續(xù)時(shí)間有關(guān)[12]。流行病學(xué)調(diào)查顯示再生障礙性貧血的年發(fā)病率約為百萬分之七，多發(fā)于小兒，其中50%以上的患者于出現(xiàn)癥狀6個(gè)月內(nèi)死亡[13]。

本研究顯示觀察組的TPO、IL-17含量高于對照組，MRE11、VEGF含量低于對照組，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRE11蛋白定位于11q21，可參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)；人體細(xì)胞如果MRE11發(fā)生突變，會導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張樣疾病，誘發(fā)患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、癌癥易感、小腦退行性變、免疫缺陷等病癥[14]；此外MRE11蛋白在細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)、維持染色體穩(wěn)定和DNA復(fù)制中都有重要的作用，其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15]。TPO能夠在不同階段參與調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的分化、血小板的生成，其是巨核細(xì)胞系特有的造血生長因子[16]。骨髓是一個(gè)非常復(fù)雜的器官，骨髓基質(zhì)又稱骨髓微環(huán)境，由結(jié)締組織和血管系統(tǒng)組成，VEGF在骨髓組織血管生成、基質(zhì)細(xì)胞增殖分化方面起著重要作用[17]；VEGF是一種具有高度生物活性的功能性糖蛋白，具有維持血管正常狀態(tài)和完整性、提高血管通透性、促血管生成作用等多種作用；VEGF基因全長共14 kb，由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子構(gòu)成，可特異地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)新生血管形成的作用[18]。

本研究顯示觀察組的Th 17Treg細(xì)胞中的RORΥ1表達(dá)水平高于對照組，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平低于對照組，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Th17細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17，在介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病等過程中發(fā)揮重要作用；IL-17也可以有效的促進(jìn)CD4+細(xì)胞分化成為Th17細(xì)胞，使嗜中性粒細(xì)胞大量聚集而發(fā)揮生理作用，進(jìn)而促進(jìn)趨化細(xì)胞因子和粘附分子的合成和釋放，從而對再生障礙性貧血的病理發(fā)展產(chǎn)生影響；IL-17也可以誘導(dǎo)其它炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞參與局部炎癥反應(yīng)和組織損傷[19]。Treg細(xì)胞具有免疫無能和免疫抑制的功能特性，可增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視功能，可減輕移植排斥反應(yīng)[20]。在存在活化的樹突狀細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-6時(shí)，Treg細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞。RORΥ1屬于核激素受體超家族成員，是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并且與IL-17表達(dá)高度相關(guān)[21]。Foxp3是轉(zhuǎn)錄因子Forkhead家族的成員之一，是Treg的特征性調(diào)控因子，同樣在Treg細(xì)胞的增殖、分化過程中起到關(guān)鍵作用[22]。當(dāng)前有研究表明Th 17Treg可能和Th1型細(xì)胞因子一樣可以產(chǎn)生直接或間接抑制骨髓造血作用，再生障礙性貧血患者骨髓及外周血Th17細(xì)胞增多并同時(shí)檢出Treg細(xì)胞的減少，且對于治療有效的病例，Th17細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)至正常水平[23]。

再生障礙性貧血主要是指骨髓干/祖細(xì)胞和造血微環(huán)境受到生物、物理、化學(xué)等各類因素破壞，使血液中的全血細(xì)胞減少的血液系統(tǒng)綜合病癥。免疫發(fā)病機(jī)制為再生障礙性貧血的研究熱點(diǎn)，T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能異常與該病的發(fā)病密切相關(guān)。Treg細(xì)胞主要來源于胸腺，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、腫瘤免疫檢測及自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[24]。MRE11作為DNA損傷修復(fù)蛋白在人體的DNA損傷修復(fù)中起重要作用，當(dāng)雙鏈DNA斷裂發(fā)生后，MRE11可以感應(yīng)斷裂的產(chǎn)生，可以使DNA的構(gòu)象發(fā)生改變，可以激活下游的效應(yīng)分子，從而有利于維持基因組穩(wěn)定[25]。當(dāng)前研究表明TPO可以直接抑制STAT3磷酸化，從而能夠調(diào)節(jié)TPO受體池的數(shù)量來改善貧血[26]?；A(chǔ)研究顯示再生障礙性貧血小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可檢測到大量產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞浸潤，抗IL-17治療可部分緩解貧血癥狀。VEGF不僅直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、游走與增殖，還可誘導(dǎo)毛細(xì)血管的生成，增加微血管通透性，促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲。VEGF也可改變細(xì)胞外基質(zhì)，使其有利于血管生成[27]；還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，且可使其濃度呈劑量依賴性升高，從而起到血管維持功能。同時(shí)Treg細(xì)胞數(shù)量及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著減少；不過只用Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)、Treg細(xì)胞減少并不能完全解釋再生障礙性貧血發(fā)病的病理生理學(xué)機(jī)制[28]。本研究也有一定的不足，再生障礙性貧血患兒的樣本數(shù)量不夠，且上述各種指標(biāo)受到外在因素的影響比較大，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在兒童再生障礙性貧血中呈現(xiàn)高表達(dá)情況，可互相影響，共同參與該病的免疫發(fā)病。

作者簡介：褚保鳳(1978-)，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：小兒血液系統(tǒng)疾病。