余雙奇,孔維健,潘 肅

(吉林大學第二醫(yī)院 骨科，吉林 長春130041)

脊髓損傷(SCI)可以導致?lián)p傷水平以下嚴重的運動和感覺功能障礙[1,2]。目前關于脊髓損傷尚無有效的治療方法。芬戈莫德，也被稱為FTY720，是一種被批準用于治療多發(fā)性硬化癥的免疫調(diào)節(jié)藥物[3]。芬戈莫德在體外對神經(jīng)干細胞的影響和對脊髓損傷的修復效果已有相關文獻對其進行了研究[4-6]。本研究將FTY720與PLGA以1%的質(zhì)量比進行混合，通過靜電紡絲技術制備PLGA/FTY720靜電紡絲膜，利用體外實驗探究了靜電紡絲膜對NSC增殖分化的影響。并通過構建大鼠脊髓損傷模型探究了在動物試驗中對脊髓損傷的治療效果。結(jié)果表明，PLGA/FTY720靜電紡絲膜能夠促進NSC的增殖分化，PLGA/FTY720紡絲膜聯(lián)合NSC能夠促進脊髓損傷的恢復，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 PLGA/FTY720靜電紡絲膜的制備

PLGA (Mw=40,000 g/mol)購自長春中諾生物材料有限公司。靜電紡絲膜的制備方法如相關文獻所述[7]。將PLGA (100 mg)和FTY720 (1 mg,Gilenya,Novartis)溶于六氟異丙醇中，質(zhì)量比為1%。然后，將混合物放入裝有0.4 mm針頭的10 ml注射器中。納米纖維采用電壓調(diào)節(jié)直流電源(DW-P203-1ACFD，天津)，施加電壓20 kv，進給速率為1.0 ml/h。收集器和針頭之間的距離為10 cm。從接收屏上收集制得的PLGA/FTY720靜電紡絲膜。純PLGA靜電紡絲膜以相同的方法制得。

1.2 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)

所有動物實驗程序均經(jīng)吉林大學動物保護與使用機構委員會批準，并符合《實驗動物保護與使用指南》。從胚胎期13.5天SD大鼠的大腦皮層中分離出NSC。這些細胞在T25培養(yǎng)瓶(corning，美國)中以50000個細胞/cm2的密度進行分離和純化，并在37℃含有5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。生長培養(yǎng)基中含有NB(Gibco,美國)、2% B27(Gibco,美國)、20 ng/mL表皮生長因子(Invitrogen，美國)、20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(Sigma，美國)和100 ng/mL青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco，美國)。培養(yǎng)的原代NSC每4天進行傳代，培養(yǎng)基每2天更換一次。傳代次數(shù)在第2-5代的NSC被用于后續(xù)的實驗研究。

1.3 細胞增殖與分化檢測

NSC以30 000/cm3的密度分別放置在純PLGA和PLGA/FTY720靜電紡絲膜上進行培養(yǎng)，以觀察不同靜電紡絲膜對NSC增殖的影響。在培養(yǎng)第1,3,7天利用MTT法對NSC增殖的情況進行評估。每孔中加入50 μl MTT溶液，37℃下孵育4 h。離心后吸去上清液，向每孔中加入100 μl DMSO溶液，振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇540 nm波長測量各孔光吸收值。利用RT-PCR技術對NSC在不同靜電紡絲膜上的分化情況進行檢測。NSC在不同的靜電紡絲膜上培養(yǎng)7天后，利用TRIzol試劑盒和PrimeScriptTM試劑盒對細胞中的RNA進行分離和純化， Tuj-1、GFAP和Oligo分別代表神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因用于結(jié)果校正。各基因引物序列為Tuj-1:GATCGGAGCCAAGTTCTG， GFAP:GCAGACCTTCTC-CAACCTG， Oligo:CGACGCCAAAGAGGAACA-G， GADPH:TCGCCAGCCGAGCCA。

1.4 大鼠脊髓損傷模型構建

成年雌性SD大鼠(200-250 g)購于吉林大學動物中心，隨機分為PLGA組(n=5)、PLGA/FTY720組(n=5)、PLGA-FTY720/NSC組(n=5)和對照組(n=5)。所有動物均氣管插管，手術過程中均維持吸入異戊烷麻醉。去除背部毛發(fā)后腹部向下固定在手術臺上，確定大鼠T9體表位置，皮膚消毒后沿背部中線切開，鈍性分離肌肉完全暴露椎管結(jié)構。咬骨鉗咬除棘突和椎板，暴露脊髓。利用眼科剪橫斷脊髓，充分止血后將大小為5 mm×3 mm的不同的靜電紡絲膜覆蓋在損傷部位表面，對照組只進行脊髓橫斷而不植入靜電紡絲膜。依次縫合肌層及皮膚，術后連續(xù)3天給予抗生素預防感染。

1.5 脊髓功能恢復評估

利用BBB運動評定量表評價大鼠后肢功能恢復情況。實驗中的大鼠在損傷后第1,2,3,4周分別進行BBB評分。采用肌電圖法檢測大鼠的運動誘發(fā)電位，評價肌肉反應。大鼠麻醉后將刺激電極置于坐骨神經(jīng)上激發(fā)運動電位，將記錄電極置入腓腸肌，記錄誘發(fā)運動電位的響應情況。

1.6 統(tǒng)計分析

所有定量數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，以均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗對兩個以上變量進行比較。P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

本研究采用MTT法測定了NSC在不同靜電紡絲膜上第1、3、7天的增殖情況。如圖1所示，在第1天時，NSC在純PLGA靜電紡絲膜和PLGA/FTY720靜電紡絲膜上在增殖情況無明顯差異。第3天時在PLGA/FTY720靜電紡絲膜上生長的NSC與PLGA組相比具有更高的OD值，第7天時兩組間OD值具有明顯的統(tǒng)計學差異，PLGA/FTY720組OD值明顯高于PLGA組。利用RT-PCR來評估NSC在不同靜電紡絲膜上的分化情況，RT-PCR結(jié)果如表1所示。PLGA和PLGA/FTY720兩組間Tuj mRNA表達水平無明顯差異。PLGA/FTY720組Oligo mRNA表達水平明顯高于PLGA組，而GFAP mRNA表達水平則明顯低于PLGA組(P< 0.05)。

表1 神經(jīng)干細胞分化RT-PCR(*，P<0.05,n=3)

為了評價靜電紡絲膜聯(lián)合FTY720和NSC在體內(nèi)治療脊髓損傷的效果，本研究建立了T9大鼠模型。利用BBB評分連續(xù)4周評估脊髓損傷后功能恢復的情況，評分結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，損傷后所有組的大鼠BBB評分均降至0分，并隨著術后恢復時間的延長逐漸增加，各組BBB評分均在損傷后第4周達到最大。損傷對照組與PLGA組相比較BBB評分無明顯差異，兩組的BBB評分均低于PLGA/FTY720組和PLGA-FTY720/NSC組。PLGA-FTY720/NSC組的BBB評分在四組中最高。PLGA/FTY720組BBB評分低于PLGA-FTY720/NSC組，但高于PLGA組和損傷對照組。

肌電圖的測量結(jié)果如圖3所示。潛伏期(latency)和波幅(amplitude)兩項指標用來評估脊髓損傷后運動功能的恢復情況。結(jié)果顯示，損傷對照組和PLGA組的潛伏期兩組之間無明顯差異，但與PLGA/FTY720組和PLGA-FTY720/NSC組相比有明顯延長。PLGA-FTY720/NSC組的運動電位潛伏期略短于PLGA/FTY720組，但兩組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在四組中PLGA-FTY720/NSC組波幅數(shù)值最大，明顯高于另外三組。PLGA/FTY720組的波幅高于PLGA組和損傷對照組，但與PLGA-FTY720/NSC組相比仍有一定差距。PLGA組與損傷對照組波幅數(shù)值最小，且兩組間無統(tǒng)計學差異。

圖1 神經(jīng)干細胞細胞增殖(*，P<0.05,n=3)

圖2 BBB評分(*，P<0.05,n=3)

圖3 肌電圖測量結(jié)果(*，P<0.05,n=3)

3 討論

脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復一直是治療脊髓損傷的關鍵問題[1,2]。損傷產(chǎn)生的不連續(xù)脊髓斷端大大降低了神經(jīng)修復的速度和效果。生物材料為結(jié)構性損傷中神經(jīng)細胞的生長和遷移提供了結(jié)構基礎，對損傷后神經(jīng)功能的恢復和恢復具有積極的影響[7,8]。然而，由于脊髓損傷后局部炎癥微環(huán)境等不良因素對NSC向神經(jīng)元分化有抑制作用，因此僅應用生物材料并不能達到較好的治療效果[9,10]。此外，內(nèi)源性NSC數(shù)量有限，不足以分化為足夠數(shù)量的神經(jīng)元。因此，將藥物與生物材料和NSC聯(lián)合應用于脊髓損傷的治療具有良好的研究前景和治療效果。FTY720對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的保護作用[11]。FTY720一般通過靜脈給藥或口服給藥來發(fā)揮作用，但有研究表明，全身應用FTY720會引起粒細胞缺乏癥等不良反應[12，13]。

本研究應用靜電紡絲技術制備了載有FTY720的靜電紡絲膜。為了探究 PLGA/FTY720靜電紡絲膜對NSC增殖分化的影響，我們將NSC在不同的靜電紡絲膜上進行了培養(yǎng)和檢測。細胞增殖實驗結(jié)果表明，在混有FTY720的PLGA靜電紡絲膜表面培養(yǎng)的NSC具有更高的OD值，這說明1%FTY720對NSC的增殖有明顯促進作用。RT-PCR結(jié)果顯示，PLGA/FTY720能明顯抑制NSC向星形膠質(zhì)細胞的分化，促進神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的形成。在脊髓損傷的功能重建過程中，神經(jīng)元可以進一步分化為功能神經(jīng)元，在信號傳遞中發(fā)揮作用，少突膠質(zhì)細胞可以促進髓鞘和軸突的再生，在功能恢復中發(fā)揮積極作用[14,15]。雖然RT-PCR結(jié)果未顯示PLGA/FTY720對NSC向神經(jīng)元分化有明顯影響，但PLGA/FTY720可促進NSC向少突膠質(zhì)細胞分化，分化形成的少突膠質(zhì)細胞可以促進軸突再生。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720對星形膠質(zhì)細胞的分化具有明顯的抑制作用，而星形膠質(zhì)細胞則可導致膠質(zhì)瘢痕形成，影響脊髓神經(jīng)功能的恢復與重建[16]。通過RT-PCR所得到的細胞分化結(jié)果與有利于脊髓神經(jīng)功能恢復的分化結(jié)果相一致，說明FTY720對脊髓損傷的恢復具有明顯的促進作用。

為了更好地評價PLGA/FTY720和PLGA-FTY720/NSC靜電紡絲膜的治療效果，本研究構建建立了T9大鼠脊髓全切模型。通過在損傷部位植入不同種類的靜電紡絲膜來探究FTY720和NSC對脊髓損傷修復的效果。BBB評分結(jié)果顯示，PLGA-FTY720/NSCs能明顯促進后肢運動功能恢復。PLGA/FTY720和PLGA單獨制成的靜電紡絲膜的也能在一定程度上恢復后肢運動功能，但效果不如載有NSC的PLGA/FTY720靜電紡絲膜明顯。這一結(jié)果說明NSC在脊髓損傷功能恢復中具有重要作用，NSC能夠明顯促進脊髓損傷后的功能恢復。神經(jīng)沖動在傳遞過程中，神經(jīng)元的潛伏期和振幅是評價神經(jīng)功能的重要指標[17]。肌電圖的結(jié)果顯示，在四組中PLGA-FTY720/NSC組具有最短的潛伏時間和最大的振幅，這說明PLGA-FTY720/NSC組對脊髓損傷修復的促進作用最為明顯，這一結(jié)果也與BBB評分所得到的結(jié)果相一致。動物實驗的結(jié)果表明，F(xiàn)TY720和NSC均能夠促進脊髓損傷功能恢復，兩者聯(lián)合應用時效果更加顯著。