苗永迪，劉文曄，趙 雷，趙書涵，豈 蕊，王隱瑜，鄭晨曦，孫 聰

(長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春130117)

肺纖維化(PF)是臨床上常見的疾病[1,2]。黃芩苷是中藥黃芩的活性成分，黃芩苷可抑制成纖維細胞合成相應基質(zhì)從而介導炎癥性疾病的發(fā)生。本研究利用不同濃度的黃芩苷干預體外培養(yǎng)的肺成纖維細胞，結(jié)合分子生物學技術(shù)觀察中藥單體黃芩苷對人肺成纖維細胞中纖維黏連蛋白(FN)的mRNA及蛋白表達，探討黃芩苷抑制人肺成纖維細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1細胞系 HFL1細胞系(人肺成纖維細胞體外培養(yǎng)細胞系)購于中國科學院上海細胞庫，置于10%優(yōu)級胎牛血清Hepes調(diào)節(jié)的DMEM細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 黃芩苷純度為91.7%，編號為XEBJ-6RQ3，購自中國藥品檢定研究所；醋酸潑尼松片，生產(chǎn)批號為20131114，購自天津天藥藥業(yè)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FN polyclonal antibody購自杭州博日生物科技。

1.1.3引物 引物由上海生工合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HFL1細胞培養(yǎng) 將細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行細胞復蘇，放置恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為37℃、5%CO2。每天固定時間觀察細胞生長狀態(tài)，待培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞長至90%以上時，加2 ml的0.25%胰酶進行消化90 s，計數(shù)傳代。

1.2.2細胞分組及給藥 將混懸后的細胞隨機分為5組，即陽性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組，每組細胞為2×105。精密稱取黃芩苷，用DMEM培養(yǎng)基稀釋濃度依次為10 mM、5 mM和1 mM，稱取醋酸潑尼松片于DMEM培養(yǎng)基中溶解，配成終濃度為1 mM，將細胞混懸液進行離心棄去上清液，加入含有相應藥物的培養(yǎng)基。

1.2.3細胞增殖抑制率檢測 當培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞處于對數(shù)生長期時加入0.25%胰蛋白酶進行消化，使貼壁的細胞吹打成混懸液，并接種在96孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)細胞至貼壁狀態(tài)，加入含有黃芩苷的培養(yǎng)基，每組在培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后加MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，離心棄掉上清，加入DMSO試劑150 μl，室溫振蕩20 min。待晶體溶解后測570 nm處的吸光度，每組設(shè)5個復孔，記錄結(jié)果。

1.2.4mRNA檢測 選用β-actin為內(nèi)參，Trizol法進行總RNA提取，RT-PCR擴增步驟根據(jù)說明書進行操作。本擴增體系共循環(huán)30次，最后保持72℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測FN的擴增產(chǎn)物，上樣順序為陽性藥組、黃芩苷高濃度組、黃芩苷中濃度組、黃芩苷低濃度組、空白組。反應條件如表2。

1.2.5蛋白檢測 將混勻后的細胞液離心棄上清，加細胞裂解液提取總蛋白，煮沸使蛋白變性，SDS-PAGE電泳上樣量為10 μl，封閉液封閉3 h，一抗(β-actin、FN)4℃孵育過夜，PBST洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后DAB顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)進行灰度值掃描。

表2 PCR反應條件

1.2.6統(tǒng)計學分析 Image J軟件對NC膜上的條帶灰度分析，利用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析，比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細胞增殖抑制率

空白組細胞生長狀態(tài)良好，無懸浮細胞且生長速度快、貼壁面積分布廣；醋酸潑尼松陽性藥組有半數(shù)細胞呈懸浮狀態(tài)，隨時間增長懸浮量呈逐漸上升趨勢；黃芩苷各濃度組部分細胞懸浮于培養(yǎng)瓶中，高濃度組較多，中濃度組次之，低濃度組較少。各給藥組干預細胞72 h，細胞增殖抑制率結(jié)果見表3，MTT結(jié)果表明黃芩苷對HFL1細胞有較大程度的增殖抑制效果，高濃度組抑制最為明顯，與空白組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表3 MTT測定細胞增殖抑制率

2.2 FN mRNA表達結(jié)果

醋酸潑尼松組和黃芩苷各濃度組干預下，F(xiàn)N mRNA表達明顯下降，與空白組比較有顯著差異(P<0.01)；組間差異比較結(jié)果顯示，F(xiàn)N mRNA黃芩苷高濃度組與中、低濃度組相比有顯著差異(P<0.01)，F(xiàn)N mRNA中濃度組與低濃度組比較有差異(P<0.05)，如圖1。

注：與空白組比較△P<0.01，與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

2.3 FN蛋白表達結(jié)果

在黃芩苷和醋酸潑尼松干預下，HFL1細胞中FN蛋白表達水平均有下降，F(xiàn)N蛋白黃芩苷高、中濃度組、醋酸潑尼松組相比空白組，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，低濃度組與空白組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。FN蛋白黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，有顯著性差異(P<0.01)，F(xiàn)N蛋白高濃度組與中、低濃度組比較均有顯著性差異(P<0.01)，中濃度組與低濃度組比較亦有顯著性差異(P<0.01)，如圖2。

注：與空白組比較△P<0.01,與醋酸潑尼松組比較▲P<0.01

3 討論

肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，HFL1的增殖受大量細胞因子的調(diào)控，在體內(nèi)細胞因子的正性與負性調(diào)控失衡時，引起肺成纖維細胞的大量增殖，進而誘發(fā)肺纖維化[3]。FN是廣泛存在的非膠原糖蛋白，肺纖維化病變時肺內(nèi)FN含量明顯增高，提示FN早期存在于肺成纖維細胞中，對肺纖維化的形成有一定的影響[4，5]。本實驗通過體外培養(yǎng)HFL1細胞，以醋酸潑尼松為陽性藥對照組，觀察黃芩苷高濃度組10 mM、中濃度組5 mM和低濃度組1 mM干預HFL1的增殖效果，孵育72 h后MTT法檢測細胞的增殖抑制率，分子生物學技術(shù)檢測給藥干預后HFL1細胞中FN蛋白及mRNA的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷對HFL1細胞抑制效果呈濃度依賴性，高濃度組與陽性藥組抑制效果相當，說明黃芩苷可有效的抑制HFL1細胞的增殖；Western-blotting和RT-PCR結(jié)果顯示，黃芩苷可有效降低FN蛋白及mRNA的表達，且濃度在10 mM、5 mM時效果明顯，與空白組比較有顯著差異，表明FN在轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中均受抑制，提示黃芩苷的抑制作用在RNA水平已有較好的效果，為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學的研究提供基礎(chǔ)。肺纖維化的發(fā)生發(fā)展與FN表達量密切相關(guān)，本研究證實黃芩苷可有效抑制FN的表達，進而改善肺纖維化的病變，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。