徐 僮，杜 歡，李 琪，王 張，張 靜，范 剛

（成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

六味木香丸為常用藏藥成方制劑，又名“如達(dá)柱巴”，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（藏藥分冊(cè)），具有止吐、止疼的功效，可用于治療“培根木布”引起的疼痛、噯氣、腹脹、嘔吐等［1］，主要由木香、巴夏嘎、余甘子、豆蔻、蓽茇、石榴子6 味藥材組成。其中，木香為君藥，氣濃香，性涼，味苦，能清煩熱，調(diào)和氣血，消積去食，可用于“培根”聚滯、煩熱［2］；余甘子、石榴子為臣藥，前者性涼、銳，能清血熱、健胃消食、生津止咳，主治培根病、消化不良癥［3］，而后者性溫，能開胃，助消化，可治療胃病、培根病、一切培龍?。?］。現(xiàn)代研究表明，六味木香丸具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗胃潰瘍損傷作用［5-6］，在質(zhì)量控制方面，已有采用HPLC 法測(cè)定木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含有量的報(bào)道［7-9］，但尚未涉及其他成分。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含有量，以期為提高該制劑質(zhì)量控制水平提供參考依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列（DAD）檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（美國Agilent 公司）；SB5200D 型超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；UPLC-1-10T 型超純水機(jī)（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）；DZKW-S-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；BSA124S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

六味木香丸9 批（批號(hào)20170708、20180620、20180620、20180620、20180815、20180905、20180912、20180912、20180915），主要購于西藏、青海、四川等地藏醫(yī)院和藏藥廠。木香烴內(nèi)酯（批號(hào)111524-201710）、去氫木香內(nèi)酯（批號(hào)111525-201711）對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院；胡椒堿（批號(hào)PS010640）、鞣花酸（批號(hào)PS010827）對(duì)照品購于成都普思生物科技股份有限公司，含有量均大于98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，20%～28% A；12～15 min，28%A；15～20 min，28%～55% A；20～35 min，55%～60%A；35～45 min，60%～65%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、鞣花酸、胡椒堿對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇分別制成3.152、1.400、3.212、4.132 mg／mL 貯備液，各精密量取5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 分別含四者0.315 2、0.140 0、0.321 2、0.413 2 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取丸劑粉末約2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，水浴回流提取40 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 取缺蓽茇、木香及石榴子、余甘子的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 對(duì)照品溶液在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD 分別為1.16%、1.22%、1.21%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)20170708），于 0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD 分別為0.98%、0.24%、0.19%、0.21%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批丸劑（批號(hào)20170708）粉末6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯含有量RSD分別為1.83%、1.98%、1.96%、1.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批丸劑（批號(hào)20170708）粉末6 份，每份約1.0 g，按100%水平加入鞣花酸（4.794 mg／mL）、胡椒堿（3.776 6 mg／mL）、木香烴內(nèi)酯（2.349 mg／mL）、去氫木香內(nèi)酯（5.810 6 mg／mL）對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.11 樣品含有量測(cè)定 取各批丸劑粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 木香為六味木香丸君藥，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯是其主要有效成分，具有明顯的抗炎、抗腫瘤、抗胃潰瘍等作用［10］；余甘子、石榴子用量較大，為臣藥，均含有沒食子酸、鞣花酸等鞣質(zhì)，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性［11-12］；胡椒堿是蓽菝中主要有效成分，具有抗炎、抗氧化等作用［13］，這些藥理活性與該制劑治療慢性胃炎、胃潰瘍等疾病基本吻合。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試測(cè)定六味木香丸中沒食子酸含有量，但發(fā)現(xiàn)該成分極性較大，出峰時(shí)間很快，不能與其他極性較大的雜質(zhì)峰分離，而且其專屬性不強(qiáng)，故最終選擇木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、鞣花酸、胡椒堿作為指標(biāo)成分。

3.2 HPLC 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2% 磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，分離效果最佳。此外，還對(duì)色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫等條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在WondaSil C18色譜柱、柱溫30 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm 條件下各成分分離度、峰型、對(duì)稱因子最佳。

3.3 提取條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了提取方法（回流、超聲、冷浸）、提取溶劑（70% 甲醇、50% 甲醇、甲醇、無水乙醇、純水）、提取時(shí)間（20、30、40、50 min）、溶劑用量（25、50、70 mL），發(fā)現(xiàn)50 mL 70%甲醇回流提取40 min 時(shí)，提取效果最佳。

3.4 含有量測(cè)定分析 9 批六味木香丸中均檢測(cè)出胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯，平均含有量分別為0.19%、0.11%、0.27%；鞣花酸平均含有量為0.08%，但有2 批未檢測(cè)出，而且差異較大，可能是原藥材來源不同造成的。余甘子、石榴子中均含有鞣花酸，文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道，不同產(chǎn)地2 種藥材中其含有量明顯不同。因此，為了控制六味木香丸質(zhì)量，在收集原藥材時(shí)要注意保證余甘子、石榴子來源的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含有量，該方法簡(jiǎn)便可行，準(zhǔn)確性、重復(fù)性較好，可為該制劑質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。