宗凌 姜鴻彥

1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科

2中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，中山大學耳鼻咽喉科學研究所

3海南省人民醫(yī)院耳鼻咽喉醫(yī)院

胚胎干細胞向神經元方向分化的研究已經較為深入，擬胚體能再現(xiàn)神經細胞分化的許多事件[1-3]。Okabe等將胚胎干細胞懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，表達神經元和神經膠質細胞的共同前體細胞的專一性標志Nestin，這些Nestin陽性細胞可誘導分化成神經元和神經膠質細胞[4]。通過擬胚體途徑進行胚胎干細胞分化誘導，是胚胎干細胞神經元分化采用最廣的策略。

羊水干細胞屬于多能干細胞，具有與胚胎干細胞相似的體外增殖和分化能力[5-10]；與胚胎干細胞體外移植不同，羊水干細胞接種活體動物不具有致瘤性，有望成為一種新的干細胞庫[11]。羊水干細胞體外懸滴培養(yǎng)，可形成與胚胎干細胞相似的擬胚體[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：人來源的羊水干細胞，接種于基底膜組織來源的內耳干細胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，飼養(yǎng)層細胞表達內耳支持細胞標志物P27kip1，形成支持接觸的三維培養(yǎng)模式。不添加外源性神經生長因子及神經元信號誘導因子，DMEM∕F12培養(yǎng)6天，羊水干細胞定向分化為功能性神經元，并表達聽覺神經元標記物GATA-3[13]。對于未經酶解消化制備飼養(yǎng)層的基底膜片段組織，是否依然對羊水干細胞具有神經誘導作用，目前仍未明確。羊水干細胞能形成與胚體干細胞相似的擬胚體，而擬胚體經誘導能定向分化為神經元。有研究表明，耳蝸毛細胞的存在對聽覺神經元的存活是必需的[14-16]。因此，本研究擬將耳蝸基底膜組織與羊水干細胞擬胚體共培養(yǎng)，不添加神經生長因子及神經元信號誘導因子，觀察耳蝸基底膜組織能否誘導擬胚體細胞分化為形態(tài)典型的神經元。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：新生小鼠(C57BL∕6J，出生1-3天內)，由中山大學中山醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 羊水取自中山大學附屬第一醫(yī)院耳聾基因產前檢查家庭，夫妻雙方均簽署了知情同意書。在孕期19-22周期間，經B超引導下，抽取孕婦羊水10ml，羊水由中山大學附屬第一醫(yī)院提供；中山大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核并同意此項研究。

1.1.3 主要試劑：α-MEM medium、胎牛血清（FBS）購于GIBCO公司，Chang B培養(yǎng)基、Chang C培養(yǎng)基購于Irvine Scientific公司，Tuj1一抗、Sox2一抗購于Abcam公司，Nestin一抗購于Santa cruz公司，c-Kit磁珠抗體購于MiltenyiBiotec公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離并培養(yǎng)擴增羊水干細胞

用磁珠抗體分選羊水中具有c-Kit標記的羊水干細胞，培養(yǎng)并傳代羊水干細胞[11,13]。

1.2.2 羊水干細胞懸滴培養(yǎng)

收集羊水干細胞制成細胞懸液，用增殖培養(yǎng)基(a-MEM medium+15%FBS+1%谷氨酰胺+18%ChangB+2%ChangC)重懸羊水干細胞，40μl（4×103個羊水干細胞）為每個懸滴體積，接種于60mm直徑培養(yǎng)皿蓋上，將蓋子翻轉并放置在充滿PBS緩沖液的培養(yǎng)皿上，每隔兩天半量換液[12]。

1.2.3 免疫熒光

鑒定擬胚體細胞，神經干性標記物Nestin、Sox2的表達。

1.2.4 耳蝸基底膜培養(yǎng)

將小鼠斷頭后，充分暴露顱底，取出聽泡移入Hanks培養(yǎng)液，在解剖顯微鏡下取出全耳蝸基底膜，用尖刀切取基底膜片段。取1ml無血清培養(yǎng)液，加入到鼠尾膠包被好的的培養(yǎng)皿中，將組織塊移入，并使其下沉到培養(yǎng)皿底部。無血清培養(yǎng)液配方如下：DMEM+1%serum-free supplement(sigma I-1884)+2.4%葡萄糖（sigma G-2020）+1%谷氨酰胺，隔日更換培養(yǎng)液[17]。

1.2.5 共培養(yǎng)

耳蝸基底膜培養(yǎng)24小時后，可見組織生長良好，外周有明顯新生上皮細胞及成纖維細胞；將羊水干細胞懸滴培養(yǎng)4天，形成的擬胚體移入基底膜培養(yǎng)皿中，換用DMEM∕F12培養(yǎng)液；此時開始用倒置顯微鏡每天觀察細胞，以捕獲出現(xiàn)神經樣細胞（細胞突起長度為胞體直徑的5倍以上）的最初時間；耳蝸基底膜與擬胚體共培養(yǎng)6天（前期研究：將羊水干細胞接種于基底膜組織來源的空心球體制備的飼養(yǎng)層，形成支持接觸的三維培養(yǎng)模式，DMEM∕F12僅培養(yǎng)6天，即可見大量形態(tài)典型Tuj1陽性神經元[13]），檢測神經元標記物Tuj1的表達。

1.3 統(tǒng)計方法

計量資料以均值±標準差（±SD）來表示,采用One-way ANOVA檢驗。所有數(shù)據(jù)輸入SSPSS 17.0，P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 羊水干細胞懸滴培養(yǎng)可形成擬胚體樣結構

我們前期已成功分離并培養(yǎng)羊水干細胞，多次傳代干性穩(wěn)定；羊水干細胞懸滴培養(yǎng)1天后，可見部分細胞聚集形成擬胚體，此時結構較疏松，邊緣不整齊（圖1A）；將羊水干細胞懸滴培養(yǎng)4天(圖1B)，可以形成類似于胚胎干細胞的擬胚體，胚體飽滿，邊界清楚，其內細胞連接緊密，生長旺盛，呈立體球形結構，外形極其規(guī)整(圖1C)，形成率96%。

圖1羊水干細胞懸滴培養(yǎng)形成擬胚體A懸滴培養(yǎng)1天；B懸滴培養(yǎng)4天；C放大圖，可見規(guī)整的立體球形結構。標尺：A,B=100μm;C=25μm。Fig.1 Amniotic fluid stem cells were cultured by hanging-drop to form embryoid body like structures.(A)hanging drop culture for 1 day;(B)hanging drop culture for 4 days;(C)magnified picture,show uniform three-dimensional spherical structure.Bar:A,B=100μm;C=25μm.

2.2 擬胚體表達神經干細胞標記物

羊水干細胞懸滴培養(yǎng)4天，形成擬胚體，表達神經干細胞標志物Nestin、Sox2（圖2），表明該擬胚體具有神經前體細胞特征[18]。of neural stem cell.(A)Nestin;(B)Sox2.Bar:A,B=50μm.

圖2羊水干細胞擬胚體表達神經干細胞標志物A Nestin；B Sox2。標尺：A,B=50μm。Fig.2 Amnioticfluidstemcellscouldformembryoidbody-like structures by hanging drop culture,which express the marker

2.3 共培養(yǎng)

將懸滴培養(yǎng)4天形成的擬胚體與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，用DMEM∕F12貼壁分化6天(圖3A)，擬胚體細胞有神經元標記物Tuj1的表達（圖3B），呈現(xiàn)紅色熒光，多分布于克隆邊緣，胞體為橢圓形，呈梭形成纖維細胞樣形態(tài)，無典型的神經元形態(tài)特征(圖3C)(以細胞突起長度為胞體直徑5倍以上的神經樣細胞表型作為形態(tài)學評價指標），突起長度僅為18±4.7μm；將Wnt-1基因質粒轉染羊水干細胞，得到穩(wěn)定表達Wnt-1的單克隆形成擬胚體，與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng),同樣無形態(tài)典型的神經元產生。

圖3羊水干細胞擬胚體與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，DMEM∕F12分化6天，(A)擬胚體與耳蝸基底膜共培養(yǎng)；(B)擬胚體表達神經元標記物Tuj1，但無典型的神經元形態(tài)特征；(C)放大圖，可見Tuj1，呈現(xiàn)紅色熒光，多分布于克隆邊緣。標尺：A=100μm;B=50μm C=25μm。Fig.3 The embryoid body were co-cultured with the organ of corti for six days by DMEM/F12.(A)embryoid body co-cultured with the organ of corti;(B)embryoid body had the expression of Tuj1,but no typical neuronal morphological feature;(C)magnified picture,the red fluorescence of Tuj1 were mostly localized on the edge of the clone.Bar:A=100μm;B=50μm C=25μm.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，將羊水干細胞體外懸滴培養(yǎng)，可形成形態(tài)均一且具有神經干性的擬胚體，表達神經干細胞標志物Nestin、Sox2。與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，擬胚體細胞雖表達神經元標記物Tuj1，但突起長度僅為18±4.7μm，無典型的神經元形態(tài)特征，說明與耳蝸基底膜共培養(yǎng)的模式不能誘導擬胚體細胞向形態(tài)典型的神經元分化。而我們前期研究證實，羊水干細胞接種于基底膜組織來源的內耳干細胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，飼養(yǎng)層細胞表達內耳支持細胞標志物P27kip1，不添加外源性神經生長因子及神經元信號誘導因子，支持接觸三維培養(yǎng)模式下，羊水干細胞可以定向分化為功能性神經元，并表達聽覺神經元標記物GATA-3，神經突起平均長度91.3μm[13]。綜合以上實驗結果分析，羊水干細胞向神經元方向分化，可能不依賴于基底膜來源的細胞分泌的可溶性神經生長因子及信號誘導因子，而是通過細胞間的支持接觸，耳蝸基底膜來源的內耳支持細胞提供的信號轉導促使羊水干細胞定向分化為功能性神經元[13]。

羊水干細胞接種在基底膜來源的內耳干細胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，無需添加外源性神經生長因子及信號誘導因子，可定向分化為功能性聽覺神經元；而羊水干細胞擬胚體與基底膜片段組織共培養(yǎng)，無法產生形態(tài)典型的神經元。推測羊水干細胞與基底膜來源的飼養(yǎng)層細胞間的直接接觸是羊水干細胞分化為聽覺神經元的前提條件。這種接觸不僅僅是二維的接觸（將羊水干細胞擬胚體與耳蝸基底膜片段組織共培養(yǎng)），更需要將羊水干細胞接種在基底膜來源的內耳干細胞空心球體制備的飼養(yǎng)層表面（羊水干細胞與飼養(yǎng)層細胞有支持接觸的關系），形成立體三維結構模式。研究表明，毛細胞的存在對聽覺神經元的存活是必需的[14-16]，因此本研究將羊水干細胞擬胚體與耳蝸基底膜片段組織共培養(yǎng)，目的在于探討耳蝸基底膜片段組織中的毛細胞為神經元分化提供的神經營養(yǎng)因子，是否會誘導羊水干細胞分化為聽覺神經元。本研究結果說明羊水干細胞分化為聽覺神經元，并不依靠基底膜細胞或是其中的毛細胞提供的神經營養(yǎng)因子。羊水干細胞擬胚體與內耳基底膜片段組織形成的二維培養(yǎng)，因為缺乏細胞間支持接觸的過程，所以羊水干細胞擬胚體無法定向分化為聽覺神經元。

基底膜來源的內耳干細胞空心球體制備的飼養(yǎng)層細胞，表達內耳支持細胞標志物P27kip1，在體外能定向誘導羊水干細胞分化為功能性聽覺神經元。內耳支持細胞在體外能促使羊水干細胞定向分化，可能是通過Wnt∕β-catenin信號通路。羊水干細胞與基底膜來源的內耳支持細胞制備的飼養(yǎng)層，在三維培養(yǎng)模式中，添加抑制劑Dkk1，檢測發(fā)現(xiàn)神經突起的數(shù)量急劇減少，只有大約21±2.5%的羊水干細胞分化為形態(tài)典型的神經元；而不添加Wnt∕β-catenin 信號通路抑制劑 Dkk1，可觀察到37±3.0%的羊水干細胞分化為神經元，且具有典型的神經元形態(tài)特征(P＜0.01,One-way ANOVA)；阻斷Wnt信號除了導致神經突起數(shù)量的顯著減少外，神經突起的長度也明顯變短(P＜0.01)，說明可能是基底膜來源的內耳支持細胞提供的Wnt信號參與調控羊水干細胞向神經元方向的分化[13]。這個定向分化體系，依賴基底膜來源的內耳支持細胞對羊水干細胞的支持接觸；內耳支持細胞可以作為一種新的神經再生支架。這些體外研究數(shù)據(jù)結果，有助于將羊水干細胞基礎研究向臨床治療方面轉化。

干細胞體外分化為神經細胞用于神經性耳聾的細胞替代治療的前景已引起關注[19-21]，羊水干細胞耳蝸內移植的替代治療，具有重要的臨床實用價值及可行性。羊水干細胞移植豚鼠耳蝸，基底膜是完整且未經處理的，而移植的羊水干細胞要想成功分化為神經元，需要解決以下這些實際問題：將羊水干細胞移植實驗鼠耳蝸，怎樣使植入的干細胞更多的向蝸管內遷移，這是首要的問題；羊水干細胞與基底膜上的內耳支持細胞形成緊密的支持接觸，還是懸浮于淋巴液中，是影響結局的關鍵；羊水干細胞定向的遷移至基底膜上的內耳支持細胞表面，并有緊密的接觸，才可能啟動信號轉導，定向分化為功能性神經元；基底膜來源的內耳支持細胞飼養(yǎng)層引發(fā)了Wnt信號細胞表面感受器及信號靶點，導致了級聯(lián)放大，引起了一些相關基因的活躍，產生出大量的神經元，因此在羊水干細胞移植運用于臨床的過程中，過表達Wnt-1可能有利于羊水干細胞移植分化效率，這些都有待后續(xù)進一步的體內實驗證實。畢竟內耳環(huán)境，比如酸堿度濃度，離子類型和濃度等是否會對羊水干細胞的體內神經元分化造成影響，還需要體內實驗進一步考量。