李莉 陳澤輝

阪崎克羅諾桿菌，又稱阪崎腸桿菌，多寄生于人和動物的腸道中，為食源性致病菌，多來源于嬰幼兒食品。阪崎克羅諾桿菌有鞭毛，兼性厭氧，屬于革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]。嬰幼兒感染后容易造成新生兒腦膜炎、壞死性結(jié)腸炎和敗血癥等，對尚未發(fā)育完全的神經(jīng)系統(tǒng)造成影響，嚴重者可導(dǎo)致死亡[2]。近年來，阪崎克羅諾桿菌感染的發(fā)生率呈上升趨勢，因而快速檢測阪崎腸桿菌，并制定相應(yīng)的防控方案在公共衛(wèi)生領(lǐng)域十分重要[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用菌株 本研究用到的菌株見表1。

1.1.2 樣品與試劑 本研究檢測采用的樣品嬰幼兒奶粉，來源于廈門市各超市。萬古霉素試劑：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。阪崎腸桿菌核酸快速檢測試劑盒：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

BSC-1500IIA2-X型生物安全柜：濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；GNP-9160型、GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HV-25型高壓滅菌器：日本平山制作所株式會社；Pico7500 2415型臺式高速離心機：廈門聯(lián)儀通醫(yī)療設(shè)備有限公司；EPPENDDO-RF型恒溫金屬?。簭B門寶能科技有限公司；IKA MS3型漩渦混合儀：福州齊力特實驗設(shè)備有限公司；BCD-218S DA型海爾冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)分離鑒定 應(yīng)用GB 4789.40-2010方法，取100 mg樣品，加到高壓滅菌過的，44℃的裝有900 mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，混勻。在（36±1）℃的環(huán)境下培養(yǎng)（18±2）h，移取1 mL轉(zhuǎn)種于裝有10 mL的mLST-Vm肉湯，于（44.0±0.5）℃培養(yǎng)（24±2）h。

分離鑒定時，將43.1 g DFI溶于1升蒸餾水，加熱煮沸、高壓滅菌、冷卻，傾注形成DFI平板，取肉湯增菌液劃線接種。劃線時將平板分成面積從大到小依次為D、C、B、A的四部分，接種環(huán)先涂抹A區(qū)，然后依次在B區(qū)、C區(qū)、D區(qū)劃線，避免D區(qū)劃線同A區(qū)相接觸，最后培養(yǎng)。

1.3.2 Lamp實驗 首先將1 mL增菌液注入離心管，離心后棄上清，洗滌沉淀后再次離心以至完全去掉上清。將裂解液加到沉淀中，再于99℃恒溫加熱10 min，離心得到上清，為粗提取DNA，將其轉(zhuǎn)移到0.2 mL無菌離心管中，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。陰性、陽性對照?fù)溶，在初次使用需將80 μL超純水添加至兩組對照的凍干粉中，溶解、混勻，-20℃保存?zhèn)溆?。干粉試劑?fù)溶時，將凍干粉試劑剪成多個檢測試劑管，數(shù)量為待檢測樣品數(shù)+2，向管中加入20 μL復(fù)溶液后保存?zhèn)溆谩U增時，將恒溫設(shè)置在63℃，將顯色指示劑、待檢測樣品核酸、陰性對照和陽性對照加到反應(yīng)管中，反應(yīng)50 min。

1.3.3 特異性實驗 選取奇異變形桿菌（CMCC 49005）、阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29544）、糞腸球菌（AS.1.2024）、腸炎沙門氏菌（CMCC 50335）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）。ATCC 29544使用GB 4789.40-2010法增菌，其余5種直接溶于營養(yǎng)肉湯，過夜培養(yǎng)后進行Lamp實驗，從而驗證特異性。

1.3.4 靈敏度實驗 將過夜后的人工污染奶粉10倍梯度稀釋。取10只無菌試管，依次為10-1、10-2……10-10，加9 mL的BPW，先吸取1 mL增菌液加到10-1管搖勻，再從10-1管中吸取1 mL至10-2管，依此法稀釋至10-10管，每管取1 mL計數(shù)，各管均行Lamp實驗，從而檢測靈敏度。

1.3.5 實際樣品檢測 對購于本地超市的20種嬰幼兒配方奶粉采用GB 4789.40-2010法進行阪崎克羅諾桿菌計數(shù)，以及試劑盒的快速檢測，比較以得出配方奶粉的質(zhì)量，同時分析Lamp法的實用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本情況

阪崎克羅諾桿菌菌株培養(yǎng)、稀釋后平板計數(shù)，如圖1所示。稀釋至10-5時，肉眼觀察到菌落遍布平板；稀釋至10-6時，菌落數(shù)分別是227和257 CFU/mL；至10-7時，菌落數(shù)分別是24和30 CFU/mL；至10-8時，菌落數(shù)分別為2和2 CFU/mL，稀釋至10-9后，肉眼不可見菌落。因此，原菌液濃度是2.0×10-8CFU/mL。

2.2 特異性實驗

采用6種標準菌株進行Lamp方法特異性實驗的結(jié)果，在自然光下，2號管（阪崎克羅諾桿菌）與陽性對照比較為熒光綠，1、3、4、5以及6號管與陰性對照為淡橙色，因而該試劑盒可以特異性地檢出阪崎克羅諾桿菌，不可檢出奇異變形桿菌（1）、糞腸球菌（3）、金黃色葡萄球菌（4）、腸炎沙門氏菌（5）和大腸埃希氏菌（6）等菌株，重復(fù)檢測得到相同結(jié)果，因此，該試劑盒特異性較高。

2.3 靈敏度實驗

增菌液經(jīng)培養(yǎng)，濃度為2.0×108CFU/mL，將其梯度稀釋，濃度依次為2.0×108～2.0×10-4CFU/mL，進行Lamp實驗，稀釋至10-7（2.0×101CFU/mL）時結(jié)果與陽性對照比，為熒光綠；稀釋至10-8及以后，與陰性對照比，為淡橙色，說明該試劑盒檢測阪崎克羅諾桿菌的限值為20 CFU/mL。用DFI計數(shù)，稀釋至10-6時，尚可檢測出菌落，稀釋至10-7及之后不能夠檢出綠色阪崎克羅諾桿菌，表明DFI平板的檢出限為200 CFU/mL。因此，試劑盒靈敏度是平板計數(shù)的10倍，本結(jié)果經(jīng)重復(fù)檢測，得相同結(jié)果。

表1 實驗用菌株

圖1 10 倍稀釋平板計數(shù)

2.4 實際樣品的檢測

通過快速檢測試劑盒對20份市售嬰幼兒配方奶粉檢測，樣品同陰性對照相比，為淡橙色，表明未檢測出阪崎克羅諾桿菌，多次檢測均未檢出，因此，奶粉符合率是100%。

3 討論

嬰幼兒配方奶粉如發(fā)生阪崎克羅諾桿菌污染，會嚴重威脅嬰幼兒的生命安全[4]。目前，我國主要以分離培養(yǎng)檢測該菌[5]，其存在檢測時間長、對檢測人員要求高、易受人為干擾、易交叉污染、不能大批量定量檢測等不足[6-7]。PCR技術(shù)雖可改善檢測質(zhì)量，但成本高、程序繁雜、實驗室要求、氣溶膠等也限制了其在基層的開展[8-9]。Lamp技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，且快速、簡單，具有較好的應(yīng)用前景[10]。

本研究中試劑盒以核酸分子檢測為原理，在自然光下可直接比較陰性對照管（淡橙色）及陽性對照管（熒光綠色），快速簡便，減少了人為因素引起的誤差。為驗證該方法特異性，本研究對6種標準菌株進行檢測，結(jié)果顯示較為理想，加之重復(fù)實驗，進一步說明檢測特異性較高。傳統(tǒng)分離鑒定方法與Lamp法相比，前者步驟較多，自前增菌、增菌培養(yǎng)，到劃線接種平板培養(yǎng)需用時4天左右，耗時較長，如未嚴格無菌操作，也容易出現(xiàn)偏差，結(jié)果與王蕊等[11]研究結(jié)論相符。試劑盒法檢測人工污染的阪崎克羅諾桿菌，從DNA提取到LAMP擴增結(jié)束，共耗時約90分鐘。無需設(shè)計引物，縮短了時間，且操作簡便，檢測成本較低。同時，結(jié)果還顯示出試劑盒的靈敏度高于平板。試劑盒對20份奶粉樣品的驗證實驗，表明Lamp在實際檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法相同，相比之下，快速檢測試劑盒在耗時、操作、攜帶以及結(jié)果判讀方面具有顯著優(yōu)勢。

綜上所述，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Lamp）技術(shù)在快速檢測嬰幼兒食品中阪崎克羅諾桿菌中有高靈敏度、高特異性、快速簡便、無污染等優(yōu)勢，在基層的快速檢測具有很好的應(yīng)用前景。