于 湛, 苗瑞丹, 韓忠保, 王 瑤, 劉麗艷, 辛士剛, 張洪波

(1. 沈陽師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 復(fù)雜體系分離與分析遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽 110034; 3. 沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 沈陽 110034)

0 引 言

吳茱萸堿(Evodiamine,Evo)是一種吲哚型生物堿,是蕓香科植物吳茱萸含有的最主要生物堿化合物之一,具有較強(qiáng)的生物活性與藥理作用[1]。經(jīng)過多年研究,人們已經(jīng)報(bào)道了Evo具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗傷害感受、減肥、強(qiáng)心、降血壓等多種藥理作用[1-3]。Evo結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 Evo分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular Structure of Evo

人血清蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是人體內(nèi)含量最豐富的一類載體蛋白。HSA的重要生理功能包括維持血管與器官組織間滲透壓以及儲存運(yùn)輸各種代謝產(chǎn)物和小分子藥物[4]。研究藥物與HSA間相互作用情況,可為開發(fā)新藥與藥物在體內(nèi)運(yùn)載機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[5]。

與其他分析方法相比,熒光光譜法具有分析速度快、操作簡便、靈敏度高、運(yùn)行維護(hù)成本低廉等特點(diǎn)[6-8]。本文利用熒光光譜法研究了Evo與HSA之間的相互作用機(jī)制,獲得了二者間相互作用類型與參數(shù),并通過分子對接模擬計(jì)算推測了二者間可能的相互作用模型。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse型熒光光譜儀(美國Agilent公司);FE20K Plus型臺式pH計(jì)(上海Mettler Toledo公司);高精準(zhǔn)型磁力攪拌水浴鍋(實(shí)驗(yàn)室自制);Cascada型超純水系統(tǒng)(美國Pall公司)。

分析純Evo來自上海如吉公司,HSA、Tris來自美國Amersco公司。文中所用其他溶劑與藥品均為分析純或更高。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用乙醇配制濃度為5×10-3mol/L的Evo儲液于暗處保存,用0.1 mol/L的pH 7.4的Tris-HCl(含0.1 mol/L NaCl)緩沖溶液配制5×10-4mol/L的HSA儲液于暗處保存。

使用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確移取七份20 μL HSA儲液,分別將它們與Evo溶液以及3 000 μL Tris-HCl緩沖溶液共同放入至5 mL離心管中,并用水定容至4 000 μL,保證其中Evo濃度分別為0、1.25、2.5、3.75、5.0、6.25以及7.5×10-6mol/L。在對該溶液恒溫水浴一段時(shí)間后立即進(jìn)行熒光分析。熒光光譜儀參數(shù)如下:激發(fā)波長(λex)是280 nm,激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,掃描范圍為285～500 nm,同步熒光光譜法中波長差(Δλ)分別為15與60 nm。

HSA的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自RCSB數(shù)據(jù)庫(代號:1AO6),將結(jié)構(gòu)文件中所含有的結(jié)晶水與陽離子去除后,直接用于分子對接模擬。Evo結(jié)構(gòu)信息取自PubChem網(wǎng)站,并通過MMFF94分子力場的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。采用Autodock 4.2程序[9]進(jìn)行分子對接,Grid選擇長、寬、高均為126 ?的立方體,間隔為0.375 ?。對接結(jié)果采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian Genetic Algorithm,LGA)優(yōu)化。分子對接中幾個重要的參數(shù)分別設(shè)置如下:ga_pop_size為150,ga_num_evals為2.5×106,ga_run為300。對接結(jié)果使用PLIP程序[10]分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Evo猝滅HSA的機(jī)理分析

HSA受紫外光激發(fā)在285～450 nm之間存在較強(qiáng)的熒光發(fā)射,最大發(fā)射波長位于347 nm。雖然HSA中存在Trp、Tyr與Phe等多種具有熒光發(fā)射能力的氨基酸殘基,但是它們的熒光發(fā)射強(qiáng)度不同,HSA的90%以上熒光發(fā)射是由Trp殘基貢獻(xiàn)的[11],而且由于HSA的最大發(fā)射波長與水溶液中Trp最長發(fā)射波長352 nm[12]相近,因此推測HSA中Trp殘基所處的微環(huán)境比較親水。

本文首先考查了水浴時(shí)間及水浴溫度對Evo猝滅HSA的影響。一份含有2.5×10-6mol/L HSA及2.50×10-6mol/L Evo的混合溶液于37 ℃水浴中分別保持0、10、30、60、90、120 min,隨后測試其在347 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度(F),其結(jié)果分別為620.61、551.29、558.14、554.73、547.58以及553.12?？梢娝r(shí)間對于Evo猝滅HSA熒光發(fā)射的影響不明顯,考慮到如果水浴時(shí)間過長可能會增加HSA被空氣氧化的可能性,因此本文選擇30 min作為水浴時(shí)間。

猝滅劑同熒光物質(zhì)之間的相互作用類型可通過Stem-Volmer方程[13]分析。

F0/F=1+Kqτ0[Q]

(1)

其中[Q]為猝滅劑濃度;F0/F為猝滅劑加入前后熒光物質(zhì)熒光發(fā)射強(qiáng)度之比;Kq為熒光猝滅速率常數(shù);τ0是未加入猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命,生物大分子的平均τ0為1×10-8s[14]。

圖2 不同溫度下Evo猝滅HSA的Stern-Volmer關(guān)系圖Fig.2 Stern-Volmer plots for the quenching of HSA fluorescence by Evo at different bathing temperature

圖2給出了不同溫度下經(jīng)過30 min水浴以及pH 7.4緩沖條件下不同濃度Evo與2.5×10-6mol/L HSA混合溶液的F0/F[13]與[Q]關(guān)系圖。由圖2可見,不同溫度下HSA的F0/F值與[Q]均呈線性關(guān)系,并且隨著溫度升高F0/F變化愈加顯著,根據(jù)(公式1)計(jì)算得到熒光猝滅常數(shù)Kq(列于表1)。如果Kq值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[15-17],則可以說明猝滅劑與熒光劑是靜態(tài)猝滅,即二者之間形成了復(fù)雜物。對圖2中數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算后發(fā)現(xiàn)3種不同溫度下其Kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L/(mol·s),由此可證明Evo是通過與HSA形成復(fù)合物的方式猝滅HSA的熒光發(fā)射,其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下,Evo與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)

可利用雙對數(shù)方程(式(2))計(jì)算靜態(tài)猝滅過程中形成的主客體復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[18]。

(2)

將圖2中各條曲線在最大發(fā)射位置處強(qiáng)度數(shù)據(jù)代入式(2),并經(jīng)線性擬合后,可得不同溫度下的KA與n,列于表1中。由這些數(shù)據(jù)可見,Evo同HSA間結(jié)合作用較強(qiáng),所形成的復(fù)合物均為1∶1型,并且隨著溫度的升高,其KA與n均呈現(xiàn)下降的趨勢。

本文采用恒波長同步熒光技術(shù)判斷Evo與HSA可能的結(jié)合位置。一般來說,恒波長同步熒光光譜法中設(shè)置Δλ=15 nm,可獲得蛋白質(zhì)中Tyr殘基的熒光發(fā)射信息,當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)可得到Trp殘基熒光發(fā)射信息。Evo猝滅HSA的恒波長同步熒光光譜如圖3所示。

由圖3可見,隨著Evo濃度的增加,左右2圖中HSA熒光發(fā)射強(qiáng)度均出現(xiàn)不同程度的猝滅,但是最大發(fā)射位置并未出現(xiàn)改變。左右2圖對比,可以看出右圖中Trp殘基的熒光發(fā)射受Evo的影響程度明顯要強(qiáng)于Tyr殘基。因此可以推斷,Evo猝滅HSA主要是通過影響其Trp殘基的熒光發(fā)射而實(shí)現(xiàn)的,而Evo在HSA上的結(jié)合位置可能位于Trp殘基附近。由于HSA序列中只有一個Trp殘基即Trp214,Evo在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)可能位于Trp214殘基附近。

圖3 Evo猝滅HSA(左Δλ=15 nm;右Δλ=60 nm)的同步熒光光譜圖。其中,HSA濃度為2.5×10-6 mol/L; 從1→7,Evo濃度分別為0、1.25、2.5、3.75、5.0、6.25以及7.5×10-6 mol/L。Fig.3 Synchronous fluorescence spectra for the interaction between Evo and HSA (left: Δλ=15 nm; right: Δλ =60 nm). Concentration of HSA is 2.5×10-6 mol/L; 1→7, concentration of Evo is 0.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0×10-6 mol/L respectively

2.2 分子對接分析

本文采用AutoDock[9]軟件推測Evo與HSA所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)[19],并通過PLIP程序分析復(fù)合物中主客體之間相互作用情況,最佳對接結(jié)果中主客體間相互作用情況見圖4。

圖4 最佳對接結(jié)果中Evo與HSA間相互作用Fig.4 Molecular contacts between the amino acid residues of HSA and Evo in the best molecular docking

由圖4可以看出,疏水與氫鍵等弱作用是Evo與HSA間主要相互作用力,也是Evo與HSA結(jié)合形成復(fù)合物的主要驅(qū)動力。HSA的Lys199、Phe211、Trp214、Leu238與Ala291等殘基形成一個疏水性口袋,Evo結(jié)合在其中。復(fù)合物中,Evo與Lys199之間存在距離為3.20 ?的氫鍵作用,同時(shí)二者之間也存在π-陽離子相互作用。在這個疏水口袋,Trp214殘基同Evo之間π-π堆積作用,因此本文推測其自身微環(huán)境將受到相應(yīng)改變,從而HSA的熒光發(fā)射將受到一定程度的抑制。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用熒光光譜法結(jié)合分子對接技術(shù)研究了Evo對HSA的猝滅作用,通過一系列實(shí)驗(yàn)得到:在水浴溫度為37 ℃、水浴時(shí)間30 min、pH為7.4的條件下,Evo對HSA具有最為明顯的猝滅作用。對熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知Evo猝滅HSA的類型為靜態(tài)猝滅,Evo同HSA形成了復(fù)合物。對不同溫度下熒光不同濃度Evo存在下HSA的熒光光譜數(shù)據(jù)依照雙對數(shù)方程計(jì)算可知復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。本文還通過同步熒光光譜法推測了Evo在HSA上可能的結(jié)合位點(diǎn)在Trp214殘基附近。分子對接計(jì)算結(jié)果表明Evo結(jié)合在HSA的Trp213及HSA的Trp214附近,處于疏水口袋中,主客體之間存在較強(qiáng)的疏水作用及氫鍵作用。