萬俊鋒 陽 波 鄭佳狀 冉茂波 宋昭君

四川省遂寧市中心醫(yī)院骨科，四川遂寧 629000

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的減少以及降解的增加是椎間盤退變的主要特征，這種分解代謝平衡的破壞進(jìn)一步引起椎間盤組織結(jié)構(gòu)的變化，最終導(dǎo)致椎間盤無法承受生理載荷，失去應(yīng)有的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致患者發(fā)生脊柱退行性改變[1-3]。因此找到合適的治療方式抑制髓核細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而延緩椎間盤退變已成為目前的研究熱點(diǎn)。

姜黃素（Curcumin）是一種在我國種植的草本植物，許多研究[4-7]表明，姜黃素具有抗炎、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過激活ERK通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的自噬從而抑制其凋亡[8]，以及姜黃素可以通過抑制NF-κB 通路從而提高軟骨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的合成和降低基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達(dá)[9]。但是姜黃素在椎間盤中的作用目前還很少研究，因此本實(shí)驗(yàn)初步探討姜黃素對(duì)人椎間盤髓核細(xì)胞退變和自噬的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人椎間盤髓核組織取自遂寧市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科收治的椎間盤突出的7 例患者，男4 例，年齡56～78 歲，女3 例，年齡61～76 歲。與患者及家屬簽訂知情同意書，并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按照Pfirrmann 等[10]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所獲得的椎間盤組織進(jìn)行分級(jí)，為Ⅳ～Ⅴ級(jí)。排除惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)病史，術(shù)后病理檢查結(jié)果均為退變的椎間盤組織。四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；姜黃素、微管相關(guān)蛋白3（LC3）B抗體和Beclin 1 抗體均購自美國Sigma 公司；GFPLC3 腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；MMP-3和MMP-13 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗體、β-actin 抗體和二抗均購自武漢博士德公司；膠原蛋白（Collagen）Ⅱ抗體購自美國SAB 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 髓核細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 將獲得的椎間盤組織用無菌PBS 液反復(fù)清洗數(shù)次，用剪刀把髓核組織剪成小的組織粒，置于含0.25%胰酶的離心管中消化1 h，然后離心取沉淀，置于含Ⅱ型膠原酶的離心管中消化4 h，用200 目濾網(wǎng)過濾，收集的細(xì)胞置于含20%胎牛血清的F12：DMEM 培養(yǎng)瓶中，放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 天更換培養(yǎng)液，1∶2 傳代。

1.2.2 MTT 檢測(cè) 選擇在對(duì)數(shù)期生長的髓核細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞長到80%左右進(jìn)行藥物處理。對(duì)照組只加培養(yǎng)基，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）組給予10 ng/mL 處理，而不同濃度的姜黃素處理組給予10、20、40、80、100、150 μmol/L的姜黃素處理，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT 20 μL 后放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入DMSO 100 μL，最后在酶標(biāo)儀490 nm 檢測(cè)每孔光度值。

1.2.3 GFP-LC3 轉(zhuǎn)染觀察 各組細(xì)胞更換培養(yǎng)基，用PBS 清洗，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 mL 培養(yǎng)基和1.5 μL GFP-LC3 腺病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后棄掉培養(yǎng)基，分別給予各實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的藥物處理，作用24 h 后，吸盡培養(yǎng)液，PBS 清洗，固定液固定15 min，PBS 液清洗，加入DAPI，37 ℃染色10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) 向各細(xì)胞瓶內(nèi)加入一定量的裂解液，置于冰上裂解30 min 后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入buffer 后加熱10 min 變性，配膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h，然后在250 mA 恒定電流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋的一抗，放入4℃過夜，加入稀釋的二抗，室溫?fù)u床上2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè) 各組細(xì)胞處理后分別進(jìn)行RNA提取，用Trizol 對(duì)各組細(xì)胞裂解提取總RNA，取2 μL總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA 并進(jìn)行擴(kuò)增。MMP-3 引物序列：上游5′-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-3′，下游5′-CATTTGG-GTCAAACTCCAACTGTG-3′；MMP-13 引物序列：上游5′-TTGATGATGATGAAACCTGGACAAG-3′，下游5′-TTGCCGGTGTAGGTGTAGATAGGAA-3′；Collagen Ⅱ引物序列：上游5′-CAGGTGAACCTGGACGAGAG-3′，下游5′-CCCACAGCACCAGTCTCAC-3′；Aggrecan 引物序列：上游5′-CTACCAGTGGATCGGCCTGAA-3′，下游5′-CGTGCCAGATCATCACCACA-3′；GAPDH 引物序列：上游5′-GCAC-CGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGG-TGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，PCR 反應(yīng)條件：95℃30 s，60℃30 s，共循環(huán)40 次，95℃10 s，65℃5 s 進(jìn)行溶解分析。以GAPDH 為內(nèi)參照標(biāo)化各組cDNA 模板，目的基因的表達(dá)值采用2-ΔΔCt法計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞活性的影響

MTT 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)姜黃素濃度為100、150、200 μmol/L 時(shí)，能夠顯著的抑制髓核細(xì)胞的活性（P ＜0.05），而姜黃素濃度為10、20、40、80 μmol/L 時(shí)對(duì)髓核細(xì)胞的生長活性沒有顯著影響（P ＞0.05）。因此考慮到以不影響髓核細(xì)胞活性的情況下盡可能地發(fā)揮姜黃素的作用，選擇姜黃素濃度為80 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 MTT 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞活性的影響

2.2 RT-PCR 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞退變mRNA 水平的影響

RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，IL-1β 顯著降低Collagen Ⅱ和aggrecan mRNA 的表達(dá)，增加MMP-3和MMP-13 mRNA 的表達(dá)（P ＜0.05）。而與IL-1β 組比較，姜黃素處理后明顯地提高Collagen Ⅱ和aggrecan mRNA 的表達(dá)，降低MMP-3 和MMP-13 mRNA 的表達(dá)（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 RT-PCR 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞退變mRNA 水平的影響

2.3 Western blot 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞退變蛋白水平的影響

Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，IL-1β 顯著降低Collagen Ⅱ和aggrecan 蛋白的表達(dá)，增加MMP-3和MMP-13 蛋白的表達(dá)（P ＜0.05）。而與IL-1β 組比較，姜黃素處理后明顯提高了Collagen Ⅱ和aggrecan蛋白的表達(dá)，降低MMP-3 和MMP-13 蛋白的表達(dá)（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞退變蛋白水平的影響

2.4 姜黃素促進(jìn)GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞自噬顆粒的增多

通過GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞后，觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和IL-1β 組髓核細(xì)胞內(nèi)自噬顆粒數(shù)很少，而姜黃素處理后髓核細(xì)胞內(nèi)的自噬顆粒數(shù)明顯增多。見圖4（封三）。

圖4 GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染后觀察髓核細(xì)胞內(nèi)自噬情況（800×）（見內(nèi)文第13 頁）

2.5 姜黃素能明顯促進(jìn)髓核細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示對(duì)照組和IL-1β 處理組髓核細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1 水平較低，而姜黃素處理后髓核細(xì)胞內(nèi)的自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1水平明顯增加（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)姜黃素對(duì)髓核細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)

3 討論

髓核細(xì)胞外基質(zhì)的改變被認(rèn)為是椎間盤退行性改變的主要問題。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，在退變椎間盤中表達(dá)下降。同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)中分解代謝蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶在椎間盤退變中上調(diào)，這是椎間盤退變中細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要原因[11-13]。研究[14]表明，IL-1β 能直接抑制椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成和增加MMP 的表達(dá)，同時(shí)本研究也提示IL-1β 處理髓核細(xì)胞后能夠抑制aggrecan 和CollagenⅡ的表達(dá)和MMP-3 和MMP-13 的表達(dá)，所以使用IL-1β 處理髓核細(xì)胞。

姜黃素在治療許多疾病包括阿爾茨海默病，骨關(guān)節(jié)炎等方面有一定療效[15-16]。研究[17]報(bào)道，姜黃素能夠抑制軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解和促進(jìn)其合成。但在椎間盤中的報(bào)道卻很少，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用姜黃素處理IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞后，髓核中Collagen Ⅱ和aggrecan的表達(dá)明顯增多，而MMP-3 和MMP-13 表達(dá)明顯下降，表明姜黃素能夠減緩椎間盤的退變，但是其具體分子機(jī)制還不是很清楚。

自噬是一種自我保護(hù)的方式，通過將細(xì)胞受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在人類退行性疾病中被廣泛研究[18-19]。研究[20]表明自噬對(duì)軟骨細(xì)胞和椎間盤的退行性過程有保護(hù)作用。姜黃素能通過促進(jìn)自噬抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[8]。但是姜黃素對(duì)椎間盤的保護(hù)作用是否與自噬相關(guān)還不是很清楚，本研究結(jié)果提示，當(dāng)給予姜黃素處理IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞后自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1 水平明顯增加，同時(shí)GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染后也發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后髓核細(xì)胞內(nèi)的自噬顆粒數(shù)明顯增多。

綜上所述，姜黃素能夠減緩椎間盤的退變，其可能的機(jī)制是姜黃素促進(jìn)髓核細(xì)胞的自噬，但是其進(jìn)一步的分子機(jī)制還有待繼續(xù)研究。