楊海淦 曹 蕊 王茂杰 陳育忠

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510000；3.廣東省中醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東廣州 510000

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的重要組成部分，約占90%[1]。自Pfrieger 等[2]1997 年首次報(bào)道膠質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)神經(jīng)元間的突觸聯(lián)系后，膠質(zhì)細(xì)胞的作用越來(lái)越引起神經(jīng)科學(xué)研究者的重視。

一氧化氮（NO）是一種非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，參與膠質(zhì)細(xì)胞各種生理及病理狀態(tài)的調(diào)控，是細(xì)胞間信息交換的重要介質(zhì)。NO 根據(jù)所處氧化狀態(tài)的不同，可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性作用[3-7]。NO 在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，而在高濃度時(shí)則可產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[8]。

歷代本草中，普遍認(rèn)為石菖蒲性味辛、苦、溫，入心、胃經(jīng)，能豁痰開(kāi)竅、化濕和胃、醒神益智，是芳香寧神、滌痰開(kāi)竅之要藥。臨床上常用于熱病神昏、癲狂、痰厥、健忘、阿爾茨海默病等疾病的治療。研究[9]發(fā)現(xiàn)，石菖蒲具有良好的腦細(xì)胞保護(hù)作用，能增加小鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低腦內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO）水平。然而，相關(guān)研究?jī)H僅局限于石菖蒲有效成分的藥理作用上，并未從免疫生化以及分子遺傳等方面進(jìn)行探討。為了進(jìn)一步從分子生化方面探討石菖蒲作用的相關(guān)機(jī)制，筆者設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（HEB，中山大學(xué)細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（Gibco 公司）；0.25% 供應(yīng)胰酶（Trypsin-EDTA）（1×）（GIBCO）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）PH 7.2 basic（1×）（GENOM）；石菖蒲飲片（康華藥業(yè)）；四甲基偶氮唑鹽比色試劑（MTT）（廣州妙博生物技術(shù)有限公司）；NO（碧云天生物技術(shù)）；倒置顯微鏡（NIKON TE300）；二氧化碳培養(yǎng)箱（HSO301T-VBA）；真空冷凍干燥機(jī)（Christ Alpha2-4LSC-Plus）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10basic V）。

1.2 石菖蒲凍干粉的制作

將100 g 石菖蒲飲片高速粉碎后轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加1000 mL 的超純水，于電熱套上加熱，猛火燒沸后調(diào)至溫火繼續(xù)煮1 h，收集第一遍的水提液；再加400 mL 超純水至藥渣中繼續(xù)第二次煎煮，時(shí)間火候同第1 次，后將2 次收集的水提液混合；將收集的水提液離心2 次（3000 r/min，5 min），收集上清液，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，最終濃縮液量約為100 mL，即藥物濃度為1 g/mL。

將濃縮液分裝于培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封好，置于-80℃冰箱過(guò)夜。隔日放于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h。干燥后將凍干粉轉(zhuǎn)移到離心管中，稱(chēng)量后分裝保存。使用前先用細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）配成濃度為1 mg/mL 的母液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HEB 置于37℃5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)將舊的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，加2 mL PBS洗2 次，去掉PBS，再加1 mL 胰酶進(jìn)行消化，時(shí)間大約1 min，迅速去掉胰酶，加入3 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，后進(jìn)行吹打，使細(xì)胞剝落，充分吹勻后平均分到2 個(gè)75 mm2的培養(yǎng)瓶中，再向培養(yǎng)瓶中加入5 mL完成培養(yǎng)基，擰好蓋子后放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活性

細(xì)胞以每孔3000 個(gè)細(xì)胞種于96 孔板種，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，分成對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液0 μg/L）、石菖蒲水提取物組，分別加入37.5、75、150、300、600、1000 μg/L 的石菖蒲水提取物。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間（24、36、48 h）。每隔12 h 取1 個(gè)96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避光，每孔加20 μL MTT 試劑（5 mg/mL），放回培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育完成后用一次性無(wú)菌注射器（1 mL）貼壁慢慢吸走含MTT 的培養(yǎng)液，再每孔加入150 mL 的DMSO，于多微孔板震蕩器上震蕩10 min。在酶標(biāo)儀上使用570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值，保存數(shù)據(jù)。

1.5 檢測(cè)NO 的表達(dá)

以每孔10 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞數(shù)種24 孔板，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加用不同濃度的LPS（0、10、100、1000、10 000、20 000 ng/mL）放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。確定LPS 濃液后，進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)分成對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液組）、石菖蒲37.5 μg/mL 組、石菖蒲75 μg/mL 組、石菖蒲150 μg/mL 組、石菖蒲300 μg/mL組、石菖蒲600 μg/mL 組。培養(yǎng)2 h 后加用LPS（1 μg/mL），放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)22 h，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取出NO 試劑盒的Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使回復(fù)室溫。用DMEM+10%FBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1～100 μmol/L），使其梯度為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔，在96 孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及培養(yǎng)液上清。按50 μL/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent Ⅰ以及Griess Reagent Ⅱ，最后在酶標(biāo)儀上使用540 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值，保存記錄數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石菖蒲水提取物藥物濃度選擇

MTT 結(jié)果提示石菖蒲水提取物對(duì)HEB 細(xì)胞活性具有顯著抑制作用（P ＜0.05），且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。而1000 μg/mL 濃度的石菖蒲水提取物出現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞活性，考慮與藥物濃度過(guò)大出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用。見(jiàn)表1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選0～600 μg/mL 的濃度范圍。

2.2 不同濃度LPS 對(duì)HEB 誘導(dǎo)的NO 表達(dá)的影響

在加用LPS 后可發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度≥100 ng/mL 時(shí)即可明顯誘發(fā)HEB 產(chǎn)生大量NO，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），而且隨著藥物濃度的不斷升高，其效應(yīng)更加明顯，提示LPS（100 ng/mL）可成功誘導(dǎo)HEB 的病理模型。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

注：與對(duì)照組（0 μg/mL）比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，#P ＜0.001

表2 不同濃度LPS 對(duì)HEB 誘導(dǎo)NO 表達(dá)的影響

2.3 不同濃度石菖蒲水提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HEB NO 的表達(dá)的影響

在LPS 誘導(dǎo)的HEB 病理模型上，加用石菖蒲水提取物后可明顯抑制NO 的表達(dá)。在低濃度37.5 μg/mL即可明顯抑制由LPS 1 μg/mL 所誘導(dǎo)的NO 高表達(dá)。隨著藥物濃度升高，其抑制作用明顯增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度石菖蒲水提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HEB NO 表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

既往對(duì)石菖蒲的藥理研究主要集中在揮發(fā)油、水煎液、水提醇沉液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用上，普遍認(rèn)為石菖蒲揮發(fā)油具有中樞鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥作用[10-14]。如早在1982 年，金維岳[15]經(jīng)過(guò)相關(guān)臨床研究后提出，用單味石菖蒲揮發(fā)油制成的注射液（0.5%總揮發(fā)油溶液）治療肺性腦病昏迷，能迅速消除意識(shí)障礙和神經(jīng)精神癥狀，有效率高達(dá)74.97%。此外，石菖蒲能促進(jìn)正常小鼠學(xué)習(xí)記憶和記憶獲得[16]。21 世紀(jì)，方永奇等[17]研究石菖蒲醒腦開(kāi)竅作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究，提出石菖蒲醒腦開(kāi)竅和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的有效部位主要是揮發(fā)油和β-細(xì)辛醚。故無(wú)論是中國(guó)歷史文獻(xiàn)資料還或現(xiàn)代臨床及機(jī)制研究結(jié)果都表明石菖蒲對(duì)大腦的正常功能發(fā)揮起到促進(jìn)作用。然而，本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲水提取物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性并無(wú)明顯作用，考慮可能與其正性作用僅僅體現(xiàn)在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)即神經(jīng)元的影響上，而對(duì)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的功能并無(wú)明顯的促進(jìn)作用。

NO 是由L-精氨酸（LArg）和分子氧為底物，在一氧化氮合成酶（NOS）的催化和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四氫生物喋呤（BH4）等因子輔助下，使L-精氨酸的胍基氮原子被氧化而成的[18]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的NOS 為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，在細(xì)胞因子、內(nèi)毒素以及某些內(nèi)源性異常蛋白的作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的NO，為病理型[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的HFB 中NO 的濃度，推測(cè)很有可能石菖蒲提取物是通過(guò)直接抑制誘導(dǎo)型NOS 的活性或影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸或分子氧兩種底物的濃度，或iNOS催化過(guò)程中所需要的各種輔助因子的合成過(guò)程有關(guān)。故而進(jìn)一步闡明石菖蒲提取物對(duì)病理型NO 的生成過(guò)程各種因子及催化酶的影響將成為我們今后努力的方向之一。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物對(duì)未誘導(dǎo)的正常HEB 并沒(méi)有抑制作用，而且MTT 結(jié)果也提示其對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，這可能與HEB 在被誘導(dǎo)活化后某基因的異常表達(dá)有關(guān)。