【摘要】：生物粘合劑具有良好的粘性與生物相容性，對于傳統(tǒng)機械傷口的修復(fù)是一種很好的選擇，目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的水凝膠力學(xué)性能差，缺乏細(xì)胞親和性和組織粘附性，不能滿足修復(fù)傷口的需求【1】。以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和巰基化的膠原（COL-SH）為原料，制備水凝膠【2】。該快速交聯(lián)生物可降解水凝膠以其優(yōu)異的凝膠降解和生物活性等可為生物組織工程提供理想的三維活性多孔支架。

【關(guān)鍵詞】： 生物粘合劑 聚乙二醇二丙烯酸酯 膠原

1、傷口修復(fù)水凝膠的優(yōu)越性

為促進(jìn)開放性傷口的愈合，臨床上傳統(tǒng)采用針線縫合、密封劑密封、或者重新連接破裂組織的方式，保護(hù)和修復(fù)創(chuàng)面，達(dá)到傷口愈合的目的。但是這些方法存在一定的缺陷，如對傷口造成二次機械損傷，細(xì)胞排斥免疫，粘附性低以及在生物環(huán)境中性能不良等問題【3】。近年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于研究具有粘性、彈性、生物相容性、無毒等優(yōu)良性狀的傷口密封水凝膠。水凝膠具有原位型促進(jìn)傷口愈合的優(yōu)點，因而關(guān)于該領(lǐng)域的研究在國內(nèi)外掀起了熱潮。例如，以硼酸為交聯(lián)劑制備Cur（姜黃素）/PVA（聚乙烯醇）水凝膠，能夠大規(guī)模合成，不受尺寸限制，并且能有效殺死細(xì)菌，加速大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合【4】；肽修飾殼聚糖水凝膠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，遷移和分泌以及促進(jìn)生長因子的生長進(jìn).促進(jìn)皮膚愈合【5】；由重組蛋白或白蛋白形成的用于外科手術(shù)粘合的生物粘合劑；由藻酸鹽多糖制備的傷口敷料；利用可見光固化的肝素水凝膠，不僅可以引入生長因子，而且能夠減少凝膠形成時間【6】；通過光交聯(lián)重組人蛋白質(zhì)原彈性蛋白，形成具有可調(diào)粘附性能的生物相容性和高彈性水凝膠密封劑【7】。水凝膠具有三維高度水合的聚合物網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)放在溶液中時，與干重相比，可以容納多達(dá)二十至四十倍的水。由于其獨特的物理性質(zhì)，這些網(wǎng)絡(luò)可以成型或鑄造成各種大小和形狀。膠原作為天然的高親水性的多肽類高分子，是生物體內(nèi)的一種纖維蛋白，在人體中總蛋白含量中占25%-33%，大量存在于骨，軟骨和皮膚中。采用膠原作為材料具有低免疫原性，膠原雖然是大分子物質(zhì) ，但結(jié)構(gòu)重復(fù)性大，與其他具有免疫性的蛋白質(zhì)相比，膠原的免疫原性非常低；膠原材料另一優(yōu)勢在于它與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用即生物相容性，其可與周圍細(xì)胞表現(xiàn)出很好的相互作用，并成細(xì)胞的一部分，還可促進(jìn)細(xì)胞的生長；膠原發(fā)達(dá)的四級結(jié)構(gòu)使其具有一定的凝血作用，可促進(jìn)血小板凝集和血漿結(jié)塊；另外膠原還具備能被蛋白酶降解的特性 ，即可生物降解性【8】。聚乙二醇（PEG）具有水溶性，并可溶于絕大多數(shù)的有機溶劑，且具有生物相容性好、無毒、免疫原性低等特點，并且在生物體內(nèi)可被較快代謝，通過腎排出體外，在體內(nèi)不會有積累。PEG可將其許多優(yōu)異性能賦予被修飾的物質(zhì)，作為表面修飾材料，PEG還可有效延長水凝膠在體內(nèi)的半衰期【9】。在本實驗中，采用PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）與巰基化膠原為基本材料，進(jìn)行自發(fā)交聯(lián)，形成具有一定生物粘性的水凝膠。對PEG兩端羥基進(jìn)行雙鍵修飾，得到PEGDA，其雙鍵可與巰基化膠原的巰基發(fā)生鍵合，從而發(fā)生交聯(lián)，得到具有一定粘附性和一定機械強度的水凝膠。采用該方法所制備的水凝膠具有良好的生物相容性，無毒，并且無需引發(fā)劑可自發(fā)交聯(lián)等顯著優(yōu)點。

2、實驗方法

2.1 COL-SH的制備【10】

將膠原（1g，0.0125mmol）溶于去離子水（150ml）中，然后用NaOH調(diào)節(jié)溶液PH=10。在4℃的條件下將琥珀酸酐（15g，0.15mol）溶于丙酮中，然后將該混合溶液滴加到膠原溶液之中。將反應(yīng)混合物的pH保持在pH9.0，并在4℃下攪拌混合物4小時。然后將該反應(yīng)溶液在去離子水中透析（MWCO=14000KDa）24h，并通過冷凍干燥收集Col-COOH產(chǎn)物.通過TNBSA測定測定的COL-COOH中剩余胺基的量為零，表明COL-COOH中羧基的DS（取代度）接近100%。將EDC（0.5g，2.6mmol）、NHS（0.3g，2.6mmol）和MEA（0.2g，1.76mmol）的水溶液依次加入到溶在去離子水（50ml）中的Col-COOH（0.5 g， 0.00625 mmol），將反應(yīng)混合物的PH用HCL（1.0M）調(diào)節(jié)至5.5，并在室溫下攪拌混合物24h，然后用NaOH（4.0M）將溶液PH調(diào)節(jié)至8.5并用DTT（二硫蘇糖醇）（1.5g，9.7mmol）處理24h。將反應(yīng)混合物用鹽水透析24h，去離子水透析5h。凍干后，得到白色固體Col-SH。

2.2 COL-SH與PEGDA交聯(lián)成凝膠

按COL-SH：PEGDA質(zhì)量比分別為1：50、1：100、1：200進(jìn)行混合，發(fā)生自身交聯(lián)，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.3 COL-SH與PEGDA交聯(lián)成凝膠

按COL-SH：PEGDA質(zhì)量比分別為1：50、1：100、1：200進(jìn)行混合，發(fā)生自身交聯(lián)，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.4溶脹實驗（質(zhì)量分析法）【11】

將干凝膠W0浸泡于20mL PBS中（PH7.4，25℃），分別在1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h稱量凝膠的質(zhì)量Wt，多余的水分用濾紙吸去，計算吸水率。

2.5.降解實驗【11】

將100mg的干凝膠浸泡于含膠原蛋白酶（5U/ml）的PBS溶液中，在37℃、100rmp/min下震蕩， 4h，8h，24h在各時間點離心除去含有膠原蛋白酶的溶液，用PBS溶液洗滌兩次，再離心，隨后冷凍干燥。降解率根據(jù)以下公式結(jié)算計算：W0為初始干重，W1為酶解后干重。

2.6水凝膠的微觀形態(tài)分析

使用掃描電子顯微鏡（日本日立公司 SU1510）觀察水凝膠（COL-SH：PEGDA=1：100）的的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。先將水凝膠樣品冷凍干燥。然后將其切開以觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

3、實驗結(jié)論

實驗制備了COL（膠原）與PEGDA質(zhì)量比為1：50、1：100、1：200的水凝膠，通過水凝膠形貌、溶脹性能、水溶解性能和酶溶解性能測試證實了COL與PEGDA質(zhì)量比為1：200的水凝膠的性能整體較好。在SEM電鏡圖中，可明顯看出水凝膠具有不規(guī)則的較密的膜狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)不僅能夠提高水凝膠的力學(xué)強度，而且可以很好的解釋水凝膠能夠溶脹拉伸等行為的現(xiàn)象。在溶脹實驗中，1：200水凝膠的溶脹比較小且變化平穩(wěn)，其交聯(lián)程度最好。因為水凝膠的形成是由于PEGDA之間形成了凝聚纏結(jié)結(jié)構(gòu)，該纏結(jié)結(jié)構(gòu)是由PEGDA鏈間羥側(cè)基間形成的氫鍵締合結(jié)構(gòu)而引起的，其作用類似于交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)點。當(dāng)PEGDA濃度增加時，單位體積內(nèi)PEGDA分子數(shù)增加，形成鏈間氫鍵凝聚纏結(jié)點數(shù)目增加，亦即交聯(lián)度增加，故溶脹比減小。通過水溶解實驗，發(fā)現(xiàn)COL與PEGDA的質(zhì)量比對水凝膠的水溶解性有顯著影響，隨著PEGDA的增加可以促使水凝膠的溶解。PEGDA比例較大的水凝膠更易于與傷口融合，能更好的在體內(nèi)降解，促進(jìn)傷口的愈合。在水凝膠的酶降解曲線中，1：200水凝膠的酶降解速率最快，可見此比例的水凝膠在生物體內(nèi)能夠更好的降解，更有利于傷口的愈合與生長。通過上述系列實驗，可以認(rèn)為COL與PEGDA質(zhì)量比為1：200的水凝膠更利于促進(jìn)傷口的愈合與生長，縮短傷口愈合的時間，更適合作為傷口敷料。

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作者簡介：姓名：于慧光（1997-） 性別：男 民族：漢 籍貫：河南省信陽市 學(xué)歷：本科 研究方向：藥劑學(xué) 單位：江南大學(xué)