姜瑛 王祥 張蕾 常懷廣

【摘要】目的：觀察γ-谷?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyl transferase， GGT）在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，探究抑制其活性后對(duì)細(xì)胞存活率及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響。方法：胰酶、膠原酶兩步消化法分離新生C57BL/6小鼠皮膚成纖維細(xì)胞并在培養(yǎng)板中培養(yǎng)至穩(wěn)定貼壁生長(zhǎng)；免疫組化方法檢測(cè)GGT在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)；生長(zhǎng)噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度GGsTOP對(duì)體外培養(yǎng)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞存活率的影響；免疫熒光觀察COL-I的表達(dá)。結(jié)果：GGT在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中廣泛表達(dá)。抑制劑GGsTOP可以促進(jìn)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖，并且使細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型-膠原（type I collagen， COL-I）蛋白水平的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：GGT 在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中廣泛表達(dá)，抑制GGT酶活性后促進(jìn)Ⅰ型-膠原表達(dá)，提示抑制劑GGsTOP可能促進(jìn)創(chuàng)面愈合再上皮化過程。

【關(guān)鍵詞】γ-谷?；D(zhuǎn)移酶；皮膚成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；Ⅰ型-膠原；再上皮化

[中圖分類號(hào)]R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）05-0014-04

GGT is expressed in mouse skin fibroblast and GGT inhibitory activities is involved in the upregulation of CollagenⅠ expression in the mouse skin fibroblast

Jiang Ying1， 2， Wang Xiang1， Zhang Lei2， Chang Huai-guang2*（1. HaiShu Dentistry Department of Stomatological， NingBoZheJiang 315000， China； 2. NingBo Vocational College of Health， Department of Stomatology， NingBo ZheJiang 315000， China）

[Abstract] Objective： To observe the gamma glutamyl transferase （GGT） expression on mouse skin fibroblasts（MSF）， and explore whether inhibitory activity of GGT influence cell survival and collagen typeⅠ（COL-1） expression. Methods： Primary mouse dermal fibroblast cells were isolated from neonatal C57BL/6 mice by trypsin-collagen two-step digestion. The expression of GGT was analyzed by immunohistochemistry， and the effects of GGsTOP on proliferation of mouse skin fibroblasts cells were evaluated by MTT assay. The collagen type Ⅰ expression wasmeasured by immunofluorescence. Results： GGT was widely expressed on mouse skin fibroblasts. Inhibitors GGsTOP promoted mouse skin fibroblasts proliferation， and immunofluorescence showed that the protein expressions of COL-1were up-regulated. Conclusion： GGT was widely expressed in mouse skin fibroblast cells， inhibitors GGsTOP was related to the up-regulation of the expression of COL-1 while inhibition activity of GGT， inhibitors GGsTOP may promote on the re-epithelialization process of wound healing.

[Key words] gamma glutamyl transferase； skin fibroblast； cell proliferation； collagen type I； re-epithelialization

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltransferase， GGT）是γ-谷氨?；h(huán)的關(guān)鍵酶，表達(dá)在細(xì)胞表面，參與內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子白三烯及前列腺素的代謝。臨床上，通常把血清中GGT水平升高作為肝臟疾病，酒精中毒，中風(fēng)和糖尿病的指標(biāo)[1-5]，并且在許多癌癥中，包括肺癌，肝癌，前列腺癌，乳腺癌中可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的GGT活性升高；生理學(xué)上，GGT活性維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原的平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[6]，這些過程均與皮膚組織愈合再上皮化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7]。為此，本研究的目的是觀察GGT在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，及抑制GGT酶活性后對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞存活以及細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型-膠原的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物C57BL/6 小鼠4只，鼠齡約為4周，由寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥品與試劑 GGsTOP （日本W(wǎng)ako）；N-乙?；腚装彼?（NAC）（美國(guó)Sigma）；抗GGT單克隆抗體（ab55138，英國(guó)abcom）；抗Ⅰ型膠原多克隆抗體（ab34710，英國(guó)abcom）；DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；0.25%胰酶-EDTA（美國(guó)hyclone）；二甲基亞砜（dimathylsulfoxide，DMSO，美國(guó)Sigma）；噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma）；姬姆薩染液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗熒光淬滅封片液（碧云天生物技術(shù)研究所）；GGsTOP溶液配制：將10mg GGsTop溶于10mL去離子水配制成10mM儲(chǔ)存液，-80℃保存。實(shí)驗(yàn)前用DMEM培養(yǎng)液將其稀釋成不同濃度條件培養(yǎng)液。

1.3儀器 超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器公司，中國(guó)，型號(hào)：HFsafe-1200TE）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國(guó)，型號(hào)：371）；倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)，型號(hào)：DMIL-LED）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)，型號(hào)：Epoch）；離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：5702 R）；微孔板振蕩器（Thermo Fisher，美國(guó)，型號(hào)：4625-1CEM）；電子天平（METTLER TOLEDO，中國(guó)，型號(hào)：EL204）。

1.4方法 ①小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及處理：來自新出生1～3 d的小鼠皮膚在含有0. 25%胰蛋白酶的離心管中4℃消化過夜。次日分離真皮并用0. 5 mg/ mLⅠ型膠原酶于37℃消化45 min，細(xì)胞混懸液過篩后用含10%FBS的DMEM 重懸后種培養(yǎng)皿，差速貼壁法去除非成纖維細(xì)胞。②姬姆薩染色染色法鑒定成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)：爬片細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色40 min后加入等量PBS混染5min，雙蒸水沖洗、干燥后光鏡下觀察。③GGT在細(xì)胞中的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)：取第四代小鼠皮膚成纖維細(xì)胞接種于24×24規(guī)格無菌處理的載玻片上，接種密度3×104/片。待細(xì)胞貼壁后棄掉原培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定，按照兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行GGT抗體染色，光鏡下觀察。④MTT法檢測(cè)牙周膜細(xì)胞的增殖：PDLC以2×103/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，無血清 DMEM液同步過夜。不同濃度抑制劑GGsTOP（5、10、20和50 μM）條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每濃度設(shè)8復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔。 1、3、5、7d后，每孔加MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解；選擇 490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值。⑤免疫熒光檢測(cè)COL-Ⅰ蛋白表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、GGsTOP組、GGsTOP+NAC組、IgG陰性對(duì)照組。皮膚成纖維細(xì)胞胰酶消化，密度1×105/mL接種于處理好的24×24規(guī)格蓋玻片上培養(yǎng)24h后，PBS漂洗3次，5min/次。按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同試劑，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30min，PBS漂洗3次，5 min/次。0.2% TritonX-100作用15min，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加非免疫山羊血清封閉液，室溫下孵育1h，傾去多余液體，不洗。滴加1%BSA稀釋的一抗，同時(shí)以同型對(duì)照（兔多抗IgG）作為陰性對(duì)照，4°C下孵育過夜。次日PBS漂洗3次，5，滴加1%BSA稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗或FITC標(biāo)記羊抗兔二抗（1： 200），室溫孵育1h。PBS漂洗3次，5 min/次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，室溫孵育10min。PBS漂洗3次，5 min/次，熒光顯微鏡下圖像采集。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)包對(duì)實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)過40min消化后，鏡下觀察部分細(xì)胞從組織游離。培養(yǎng)后1～2d，鏡下觀察部分游離出的細(xì)胞失去活力，漂浮培養(yǎng)液中；并可見活細(xì)胞已貼壁，形態(tài)為梭形、圓形或多角形。圓形和多角形為上皮細(xì)胞樣形態(tài)，梭形為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。早期上皮細(xì)胞生長(zhǎng)占有優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)4d后（如圖1 a），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)。培養(yǎng)7d左右，成纖維細(xì)胞基本鋪滿瓶底，匯合成單層，并混有少量鋪路石樣、扁平狀多角形的上皮細(xì)胞（如圖1 b）。傳代后成纖維細(xì)胞長(zhǎng)梭形，漩渦樣生長(zhǎng)（如圖1 c）。

2.2 GGT在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)組織學(xué)結(jié)果

在Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡下觀察，使用Nikon DS-Ri采集系統(tǒng)、NIS-Elements BR3.0圖文處理系統(tǒng)攝片。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示小鼠皮膚成纖維細(xì)胞膜有棕黃色顆粒，進(jìn)一步證實(shí)GGT作為膜蛋白，在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)（如圖2）。

2.3 GGsTOP對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，光鏡顯微鏡下不同濃度GGsTOP沒有對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，沒有出現(xiàn)壞死的細(xì)胞，并呈漩渦樣生長(zhǎng)（如圖3A）。 MTT結(jié)果顯示濃度為5、10、20和50 μM GGsTOP處理1、3、5d后沒有對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響，而10 μM GGsTOP在7d時(shí)較對(duì)照組增殖活性增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（如圖4B）。以上結(jié)果說明5～50 μM GGsTOP對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞是安全濃度，并且10 μM GGsTOP可以促進(jìn)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖。

2.4 GGsTOP促進(jìn)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞COL-I合成免疫熒光 結(jié)果顯示，COL-I定位于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中不表達(dá)。10和20 μM GGsTOP組細(xì)胞中COL-I有明顯的陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)，且信號(hào)明顯強(qiáng)于對(duì)照組；Ig G組（Negative） COL-I信號(hào)表達(dá)為陰性（如圖5）。

3 討論

γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶是維持細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外谷胱甘肽平衡的關(guān)鍵酶，并且作為判斷肝損傷程度常用的臨床指標(biāo)。GGT在不同的組織和器官表達(dá)和功能具有差異性。據(jù)研究，GGT在腎近曲小管、肝膽小管和腦毛細(xì)血管中免疫組織化學(xué)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)[8]。本研究關(guān)注皮膚成纖維細(xì)胞中GGT的陽(yáng)性表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)抑制酶活性加入抑制劑GGsTOP后細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形，并且沒有出現(xiàn)壞死的細(xì)胞，表現(xiàn)出健康的成纖維細(xì)胞形態(tài)[9]。先前有研究表明GGT的傳統(tǒng)抑制劑acivicin可以使癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[10]。并且也有研究證明acivicin可以延長(zhǎng)果蠅生命周期，具有抗衰老的功能[11]。因此，我們分析可能是不同的細(xì)胞類型、分化的不同階段及培養(yǎng)條件共同決定了GGsTOP促進(jìn)增殖的作用。

研究表明GGT活性的改變可以使細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)短暫的氧自由基ROS的改變，Zalata[12]觀察精子內(nèi)GGT的活性與ROS的產(chǎn)生呈反比例關(guān)系，也就是抑制GGT活性可以促進(jìn)ROS產(chǎn)生。該觀點(diǎn)也與Johnsen等人研究一致[13]。目前有許多研究證實(shí)ROS作為一種信號(hào)分子，直接參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)控。創(chuàng)口附近的表層細(xì)胞層內(nèi)形成的ROS對(duì)于損傷機(jī)制十分敏感，可以直接激活MAPK信號(hào)通路，并且ROS可以通過BMP/SMAD信號(hào)通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移[14]。

COL-Ⅰ是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分[15]，其正常合成可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)創(chuàng)面的愈合起到至關(guān)重要的作用[16]。細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和遷移產(chǎn)生重要影響，也參與了創(chuàng)面愈合的過程[17]。在創(chuàng)面修復(fù)早期，成纖維細(xì)胞被激活、合成并參與分泌膠原，膠原蛋白在瘢痕形成和創(chuàng)面愈合中均起到一定作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[18]，小鼠創(chuàng)面難愈合與結(jié)締組織含量降低有關(guān)，而結(jié)締組織含量又與成纖維細(xì)胞和膠原蛋白的減少密切相關(guān)，這提示了膠原蛋白在細(xì)胞增殖和創(chuàng)面愈合中的作用。創(chuàng)面的愈合與瘢痕形成有關(guān)，瘢痕形成一般認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度沉積和降解減少的結(jié)果[19]。基于以上原因，我們決定分析GGsTOP作用下小鼠成纖維細(xì)胞COL-Ⅰ蛋白水平的變化。通過結(jié)果分析，在不同濃度的GGsTOP均可以在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)COL-Ⅰ蛋白表達(dá)，加入抗氧化劑NAC抑制COL-Ⅰ的合成。該結(jié)果說明GGsTOP可以通過上升小鼠成纖維細(xì)胞中COL-Ⅰ水平促使不成熟的皮膚成纖維細(xì)胞向成熟的具有功能的皮膚成纖維細(xì)胞分化。然而GGsTOP通過何種具體機(jī)制發(fā)揮功能仍需進(jìn)一步研究。

總之，我們首次證實(shí)了GGT在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)。GGT的新型抑制劑GGsTOP沒有抑制小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，并且與COL-Ⅰ的表達(dá)相關(guān)；并且也同樣證實(shí)了GGsTOP促進(jìn)牙周膜細(xì)胞COL-Ⅰ的表達(dá)可能與內(nèi)源性ROS的改變有關(guān)，加入抗氧化劑NAC抑制COL-Ⅰ的合成。因此，以上結(jié)果為GGsTOP作為一種輔助皮膚組織愈合的藥物提供了可能。

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基金項(xiàng)目：寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （編號(hào)：202003N4187）

作者簡(jiǎn)介：姜瑛（1986.11-），女，滿族，遼寧，博士，主治醫(yī)師；研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。

*通信作者：常懷廣，博士，副主任醫(yī)師；研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。