韓雨梅 羅昕 冀里棟 田俊生 秦雪梅 李建英

摘?要：目的：研究肝臟ZAG在耐力運動改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗中的作用機制。方法：雄性 Wistar大鼠32只隨機分成安靜對照組（N）、運動對照組（Ne）、IR安靜組（IR）和IR運動組（IRe）。高脂飼料喂養(yǎng)建模（IR）5周，高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗驗證模型成功。運動干預(yù)6周，轉(zhuǎn)輪運動，20 m/min，45 min/天，5天/周。6周運動末禁食12 h后再次鉗夾試驗評價胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，次日脫臼處死，全自動生化分析儀檢測大鼠CHOL、HDL-CHOL、LDL-CHOL、TG水平，ELISA檢測血清FINS，Western-blot檢測肝臟ZAG和PGC-1a蛋白表達。結(jié)果：1）5周高脂飼料喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)大鼠IR模型;2）IR組FINS、CHOL和TG顯著高于N組，GIR顯著低于N組，呈現(xiàn)IR的代謝特點;Ne組比N組大鼠體重極顯著下降，F(xiàn)INS顯著提高。IRe組比IR組大鼠體重、FINS均顯著下降，GIR極顯著性提高。3）IR組大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達均顯著低于N組，Ne組和IRe組大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達均顯著高于各自安靜對照組。4）大鼠肝臟ZAG蛋白表達量與HDL-C、GIR、PGC-1α蛋白表達量顯著正相關(guān)，與CHOL、TG、FINS顯著負相關(guān)。結(jié)論：1）耐力運動可以提高IR大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達，改善血脂代謝，改善IR狀態(tài)。2）耐力運動過程中大鼠肝臟ZAG可能通過促進線粒體生物合相關(guān)因子PGC-1α表達而發(fā)揮刺激脂肪分解的作用。

關(guān)鍵詞：ZAG;PGC-1α;肝臟;胰島素抵抗;耐力運動

中圖分類號：G804.2?文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2019）04-0080-07

Abstract：Objective：To investigate the effects of liver Zinc-α2-glycoprotein （ZAG） on improving insulin resistance by endurance exercise in high-fat diet induced insulin resistant rats. Methods：32 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：quiet control group （N），exercise control group （Ne），IR group （IR） and IR exercise group （IRe）. IR model group rats were fed with high-fat-diet for 5 weeks，and the insulin sensitivity was evaluated by improved high insulin-euglycaemic clamp test. The exercise program was that the rats were acclimatized to the motorized wheel running，20 m/min，45 min/day，five days per week，for a total of six weeks. After fasting 12 h in 6 weeks of exercise，the insulin resistance of all rats was evaluated by improved high insulin-euglycaemic clamp test again and then all rats were executed the next day. The serum lipid （CHOL，HDL-CHOL，LDL-CHOL，TG） levels were detected with the full-automatic biochemical analyzer. The serum fasting insulin level （FINS） was detected by using ELISA Kit，and the expression of ZAG and PGC-1α protein in liver was measured by Western-blot. Results：1） 5 weeks high-fat-diet successfully induced the IR of the rats; 2） IR group had higher FINS，CHOL and TG but lower GIR than N group，and presented the metabolic characteristics of IR. The Ne group had lower weight and higher FINS than N group，respectively. The IRe group had lower weight and FINS but higher GIR than IR group. The results revealed that endurance exercise significantly improved the rat IR; 3） Compared with N group，the expression of liver ZAG and PGC-1α protein in IR group was significantly reduced ，and the expression of ZAG and PGC-1a protein in the Ne and IRe groups were significantly higher than N and IR groups respectively. 4） ZAG protein expression in rat liver has shown significant positive correlation with HDL- C，GIR and PGC-1α protein expression，and shown significant negative correlation with CHOL，TG and FINS. Conclusion：1） Endurance exercise can increase the protein expression of ZAG and PGC-1α in liver of IR rats，ameliorate blood lipid metabolism and improve IR state.2） ZAG may stimulate adipose decomposition by promoting mitochondrial biogenesis factor PGC-1α protein expression in rat liver during the endurance exercise.

Key words：ZAG;PGC-1α;liver;insulin resistance;endurance exercise

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于其正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為胰島素作用的靶組織（骨骼肌、肝臟和脂肪）和靶器官對胰島素敏感性及反應(yīng)性降低[1]。研究證實，IR與心血管疾病、代謝綜合征、肥胖、癌癥和2型糖尿病等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。肥胖可以通過誘導(dǎo)IR，增加2型糖尿病的風(fēng)險。新近有學(xué)者提出，肥胖癥中IR是細胞能量過剩的結(jié)果[3]。鋅-α2-糖蛋白（Zinc-α2-glycoprotein，ZAG）是一種新型的脂肪因子，它在脂肪動員和利用方面發(fā)揮重要作用[4]，它可以通過特定的脂肪消耗誘導(dǎo)超重和肥胖動物體重減輕[5]，并有利于預(yù)防高脂飲食引起的肝臟脂代謝紊亂[6]，然而關(guān)于ZAG與IR的關(guān)系尚存在爭議[7-9]。

有研究指出，脂肪組織中ZAG促進脂肪分解的作用可能是通過促進過氧化物酶體增殖激活受體（PPARγ） 輔激活子1 α（peroxisome proliferator-activated receptor- α （PPARγ） coactivator 1 α ，PGC-1a）等線粒體生物合成相關(guān)因子表達而刺激線粒體生物合成實現(xiàn)的[10]，人類前脂肪細胞ZAG基因沉默可導(dǎo)致PGC-1α mRNA表達下降[11]，然而肝臟中ZAG與PGC-1α的關(guān)系卻知之甚少。

運動是改善IR的有效手段，也是國際上公認的控制肥胖最安全有效的途徑[12]。運動對IR狀態(tài)下ZAG影響的研究有限，多數(shù)集中在血清和脂肪組織，肝臟作為脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的重要器官，無疑在IR和運動過程中對機體脂肪代謝產(chǎn)生重要影響。本研究通過觀察IR以及耐力運動對大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達的影響，探討ZAG表達與IR及其脂代謝的關(guān)系，為運動干預(yù)IR相關(guān)疾病的治療尋找新的作用靶點。

1?材料與方法

1.1?實驗對象及IR建模分組

2月齡SPF級Wistar雄性大鼠32只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（動物許可證號：SCXK（京）2011—2012）。標準動物房飼養(yǎng)，室溫24℃±1℃，濕度45%±15%，明/暗：12 h/12 h。常規(guī)分籠，自由進食和飲水，普通飼料喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，對照組喂食普通飼料（脂肪10%、蛋白質(zhì)21%、碳水化合物69%），IR模型組喂食高脂飼料（脂肪59%、蛋白質(zhì)20%、碳水化合物21%，購自北京華阜康生物科技股份有限公司），共飼養(yǎng)5周。

建模期5周結(jié)束后采用改良的高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗進行模型驗證。建模成功后，將IR模型組大鼠和對照組大鼠分別隨機分為安靜對照組（N）、運動對照組（Ne）、IR安靜對照組（IR）和IR運動組（IRe），IRe組與Ne組大鼠分別進行6周運動干預(yù)，運動干預(yù)期間IR和IRe組大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2?高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗

高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)是目前國內(nèi)外公認的評價胰島素抵抗（IR）的金標準[13]，本研究中大鼠建模5周后禁食12 h，采用改良鉗夾術(shù)對模型進行評價。大鼠固定，溫水擦洗尾部，用50 U/mL肝素生理鹽水沖洗留置針，將其刺入大鼠一側(cè)尾靜脈根部1/3處，隨后連接微量注射泵（型號：RWD202瑞奧德）。另一側(cè)尾靜脈末1/3處取血檢測BBG。開啟注射泵的INS通道以0.12 U/（kg·h）的速度輸入胰島素，每隔10 min重復(fù)尾靜脈取血測定血糖（GLU），GLU值超出BBG±0.5 mmol/L時，使用注射泵的第二通道注射27.5%的葡萄糖。根據(jù)大鼠GLU變化隨時調(diào)節(jié)注射泵的平均葡萄糖輸送速率（glucose infusion rate，GIR），使GLU值穩(wěn)定在（BBG±0.5）mmol/L水平。60 min后，GLU值連續(xù)3次穩(wěn)定在既定水平時，提示大鼠血糖進入穩(wěn)態(tài)，表明內(nèi)源性胰島素及葡萄糖調(diào)節(jié)被抑制，鉗夾建立成功。記錄大鼠60～120 min穩(wěn)態(tài)時間段內(nèi)葡萄糖輸送速率（GIR），以此反映外周組織對胰島素的敏感性，GIR越高，說明機體對胰島素越敏感，反之，越不敏感。血糖變異系數(shù) （CVGLU） 反映鉗夾實驗的準確性;GIR變異系數(shù)（CVGIR） 反映鉗夾試驗的可靠性。

變異系數(shù) CV =（標準偏差 SD / 平均值Mean）×100%

1.3?運動干預(yù)方案

Ne組和IRe組大鼠適應(yīng)性運動1周，第1～5天運動時間分別為20 min、25 min、30 min、35 min和45 min;此后采用Bedford跑臺方案二級負荷[14]相同的轉(zhuǎn)輪運動（大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機型號：北京眾實迪創(chuàng)YLS-15A）進行干預(yù)：20 m/min，45 min/天，5天/周，持續(xù)運動6周。

1.4?樣品的收集與處理

大鼠6周轉(zhuǎn)輪運動結(jié)束禁食12 h，采用改良的高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗再次檢測大鼠GIR，用于評定IR，次日大鼠脫臼處死（禁食12 h），股動脈取血，靜置30 min后，4℃，3 000 rpm離心15 min，留取血清檢測生化指標。分離并留取大鼠肝臟組織，分裝后迅速置于液氮，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?血液生化指標的測定

1）BBG采用便攜式血糖儀（德國羅氏Accu-Chek）檢測，血脂指標（CHOL、HDL-C、LDL-C、TG）委托太原市食品藥品檢驗所檢測。

2）空腹血清胰島素（FINS）測定：采用碧云天生物技術(shù)有限公司ELISA檢測試劑盒，嚴格按照說明書方法于酶標儀（BIO-RAD 680）上進行測定。

1.6?Western blot檢測

每組準確稱取100 mg肝臟組織，加入1 ml PIPA組織裂解液，10 μl PMSF，Twflon電動勻漿器勻漿后靜止30 min，使其完全裂解。4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清液， BCA法測量樣品蛋白濃度，調(diào)齊shagn2樣量（50 μL/well）。使用碧云天SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，8%SDS聚丙乙烯酰胺凝膠電泳，4×Loading buffer混合SDS-PAGB蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸30 min使蛋白變性，蛋白上樣到加樣孔中，開始60 V穩(wěn)壓，30 min，然后120 V穩(wěn)壓，繼續(xù)電泳90 min。電轉(zhuǎn)恒流200 mA，2 h后可見Marker已完全轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后用5 %脫脂奶粉進行封閉，37℃，2 h。洗膜后加入ZAG（Santa Cruz 公司，1∶300稀釋）、PGC-1α（Santa Cruz 公司，1∶500稀釋）和β-actin（Mrcgene 公司，1∶1 500稀釋）一抗，4℃孵育過夜。次日用TBST液清洗3次，每次10 min。PVDF膜條帶放入相應(yīng)二抗（1∶2 500的比例稀釋）中封口，溫室搖床孵育90 min，洗滌3次，每次10min。加入一定量的超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，均勻地覆蓋到膜表面，冷卻1至2分鐘之后在Flour Chem凝膠成像系統(tǒng)中測定目的蛋白灰度值。灰度值（目的蛋白）/灰度值（β-actin 蛋白）等于目的蛋白相對含量。

1.7?數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標準差（[AKX-]±SD）表示，5周后建模數(shù)據(jù)采用t檢驗分析，其他數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析（General Linear Models-Multivariate），P<0.05 表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

2?實驗結(jié)果

2.1?5周高脂飼料喂養(yǎng)后高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗結(jié)果

如表1所示， IR模型組比對照組大鼠體重和基礎(chǔ)血糖值顯著提高，說明大鼠具有肥胖和2型糖尿病發(fā)展傾向，但由于基礎(chǔ)血糖值<16.7mmol/L，說明IR模型組大鼠尚未達到2型糖尿病標準[15];同時IR模型組GIR值極顯著低于N組，說明外周組織葡萄糖利用率下降，表明胰島素抵抗模型誘導(dǎo)成功;兩組大鼠的CVGLU和CVGIR均小于15%，表明本次鉗夾試驗準確可靠。

2.2?耐力運動后各組大鼠IR相關(guān)指標的變化

如表2所示，IR組與N組相比，血清FINS極顯著升高，GIR極顯著下降，呈現(xiàn)出了IR的代謝特點;Ne組與N組相比，大鼠體重顯著性下降，F(xiàn)INS顯著增加。IRe組比IR組大鼠體重、FINS均顯著下降，GIR極顯著性提高。

2.3?耐力運動后各組大鼠血脂四項指標的變化

由圖2可見，與N組相比，IR組與大鼠CHOL和TG均顯著升高;Ne組各指標沒有顯著改變。IRe組比IR組大鼠CHOL和TG均極顯著下降。

2.4?耐力運動后各組大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達量變化

由圖3、圖4可見，與N組相比，IR組大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達均顯著降低，6周耐力運動后Ne組和IRe組肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達均顯著高于各自安靜對照組。

2.5?大鼠肝臟ZAG蛋白表達與血脂四項及肝臟PGC-1α蛋白表達的相關(guān)性

如表3所示，大鼠肝臟ZAG蛋白表達分別與HDL-CHOL水平、PGC-1α蛋白表達、GIR顯著正相關(guān)，與CHOL、TG和FINS 顯著負相關(guān)，與LDL-CHOL無統(tǒng)計學(xué)意義。

3?分析與討論

3.1?IR大鼠模型的建立及其評價

高脂飲食誘導(dǎo)的IR模型具有糖耐量受損和2型糖尿病早期的穩(wěn)定特性[16]，高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗是國際上公認的評價IR的金標準[17]。本研究中大鼠經(jīng)過5周高脂喂養(yǎng)后IR模型組比對照組GIR值極顯著性降低，提示外周組織葡萄糖利用率下降，IR模型誘導(dǎo)成功;同時IR組體重、BBG顯著增加，說明IR模型組存在肥胖、糖尿病發(fā)展傾向;但IR模型組體重未超出對照組體重20%，且BBG<16.7mmol/L[15]，說明IR模型組大鼠尚未達到2型糖尿病狀態(tài)。

3.2?耐力運動對IR大鼠生理生化指標的影響

研究表明，脂代謝紊亂是IR常見表現(xiàn)，它既是IR 的重要組成要素，也是導(dǎo)致冠心病等的主要危險因素。在非脂肪組織中，過度的TG積累會對細胞產(chǎn)生毒性作用，并降低對胰島素的敏感性，最終導(dǎo)致糖尿病和代謝綜合癥[18]，高TG是血脂異常的顯著特征之一[19]，高CHOL似乎與IR沒有直接相關(guān)性[20]，可能與腸道菌群的缺失有關(guān)[21]。本研究中IR組大鼠呈現(xiàn)出了IR的特征，F(xiàn)INS、TG和CHOL顯著增加，GIR顯著降低。耐力運動后上述指標均得到了有效逆轉(zhuǎn)，血脂代謝改善，與多數(shù)文獻報道一致[22-23]，整體來看，耐力運動對IRe組干預(yù)效果比Ne組更加明顯。

3.3?耐力運動對IR大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達的影響

ZAG是首先在人類血漿中分離出來的一種新型脂肪因子，分子量 43KDa，其名稱來源于其沉淀鋅鹽的傾向和在 α2-球蛋白區(qū)域的電泳遷移率[24]。近年來研究證實，ZAG具有強烈促進脂肪分解，減少脂肪積聚的重要作用[4]。ZAG廣泛表達于脂肪組織、肝臟、胃腸道、前列腺等，并可以分泌到血清和其他體液中[25]。最初認為ZAG 作為脂質(zhì)動員因子在癌癥病人惡病質(zhì)中發(fā)揮促進脂解的重要作用，目前發(fā)現(xiàn)ZAG并非癌癥特異性的脂解調(diào)節(jié)器，健康人體在熱量限制后脂肪組織ZAG也會分泌增加，是一種普通的脂質(zhì)分解代謝標志物[26]。ZAG與IR的關(guān)系目前尚存爭議，有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者血清、脂肪組織和肝臟ZAG表達均顯著下降，然而與IR無相關(guān)關(guān)系[9]。另有研究顯示，ZAG指數(shù)比其他指標更能有效預(yù)測IR[7]。此外，肥胖者皮下脂肪而非內(nèi)臟脂肪中ZAG含量顯著下降，臨床和細胞分子證據(jù)顯示ZAG在調(diào)節(jié)全身及皮下脂肪組織胰島素敏感性中發(fā)揮重要作用[11]。本研究觀察到IR組大鼠肝臟ZAG蛋白表達較N組顯著下降，且大鼠肝臟ZAG含量與GIR、HDL-C顯著正相關(guān)，與FINS、CHOL、TG顯著負相關(guān)，提示大鼠肝臟ZAG蛋白表達與IR密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，人類原代脂肪細胞中ZAG基因沉默可以導(dǎo)致脂聯(lián)素、胰島素受體底物1（IRS1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 （GLUT4）和線粒體生物合成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α mRNA表達下降，表明ZAG與線粒體生物合成有關(guān)[11]，可能通過刺激線粒體生物合成，增加組織的脂質(zhì)氧化作用從而起到促進脂肪分解的作用。脂肪分解是甘油三酯最終轉(zhuǎn)化成乙輔酶 A的過程， 線粒體脂肪酸 β 氧化是脂肪分解利用的關(guān)鍵步驟。肥胖相關(guān)疾病發(fā)生早期，脂肪酸β氧化減少與線粒體功能受損有關(guān)，會導(dǎo)致細胞內(nèi)游離脂肪酸增加。細胞持久而過量的脂質(zhì)蓄積，將導(dǎo)致細胞氧化磷酸化和ATP合成酶功能低下，加重氧化損傷和線粒體DNA衰竭，導(dǎo)致脂肪細胞線粒體功能失調(diào)[27]。研究表明，線粒體功能障礙與胰島素抵抗、糖尿病、肥胖等發(fā)病密切相關(guān)[1，28]。研究人員將ZAG質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到3T3-L1（前脂肪）細胞中，發(fā)現(xiàn)ZAG對線粒體生物合成相關(guān)因子PGC-1α 、NRF-1/2、mtTFA mRNA表達有促進作用，并進一步證實這種作用通過PKA和p38MAPK信號通路介導(dǎo)[27]。Xiao等研究表明，肝臟ZAG過度表達明顯抑制了脂肪的生成，促進了脂肪分解和脂肪酸β氧化，減少了細胞內(nèi)脂肪的積累;ZAG敲除則顯著抑制了脂肪酸β氧化，增加脂肪生成和脂質(zhì)積累，表明ZAG有減輕脂肪肝的積極作用，是脂肪肝治療的一個很有前景的目標靶向[25]。本研究中IR組大鼠肝臟PGC-1α 蛋白表達顯著低于N組，并且與ZAG 蛋白表達顯著正相關(guān)，可能是導(dǎo)致IR組大鼠肝臟脂肪分解能力下降，輸出TG增多，導(dǎo)致血液TG和CHOL異常升高 的機制之一。血液中高水平TC可以與葡萄糖競爭進入細胞，影響葡萄糖的利用和代謝，還會抑制胰島素與其受體結(jié)合，導(dǎo)致血中胰島素水平升高[29]。

運動鍛煉能夠引起機體一系列的代謝適應(yīng)，并且是預(yù)防和治療IR的有力工具[30]，然而關(guān)于運動與ZAG關(guān)系的研究文獻相對較少。劉瓊等認為，運動可能通過興奮交感神經(jīng)，作用于 β3-腎上腺素受體來促進肝臟 ZAG mRNA 表達水平的增加，進而影響脂代謝[12]。也有研究指出，肥胖者鍛煉6個月后腹部脂肪ZAG mRNA表達無顯著改變[31]。PGC-1α是一種多功能輔助活化因子，是代謝適應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑，它可以誘導(dǎo)線粒體生物合成以及適應(yīng)性產(chǎn)熱，也與糖尿病、運動過程中的能量代謝、肥胖等密切相關(guān)[32-33]。 耐力運動可以促進飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟PGC-1α的表達增加，提高胰島素的積極作用[34-35]，然而PGC-1α與ZAG關(guān)系尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)耐力運動均可誘導(dǎo)IR大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達顯著增加，且二者顯著正相關(guān)，結(jié)合前人研究結(jié)果，可以推測耐力運動過程中大鼠肝臟ZAG可能通過促進線粒體生物合相關(guān)因子PGC-1α表達而發(fā)揮刺激脂肪分解的作用。

ZAG表達受多種因子調(diào)節(jié)，如PPARγ和糖皮質(zhì)激素、腫瘤壞死因子-α、脂聯(lián)素和瘦素等[12]。除了脂肪動員和分解作用外[5]，ZAG還具有促進精子能動性、充當(dāng)載體蛋白、參與免疫調(diào)節(jié)與抑制、細胞粘附、核糖核酸酶活性、調(diào)節(jié)黑色素產(chǎn)生和阻礙腫瘤擴散等諸多作用[36]。最新證據(jù)表明，ZAG還可能參與了心衰、炎癥反應(yīng)、血液透析相關(guān)的心血管疾病以及肌萎縮的病理機制[37-40]。目前 ZAG與IR的相關(guān)研究文獻有限，ZAG改善IR的具體分子機制還未完全闡明?？傊?，ZAG作為新近鑒定的脂肪動員因子，其在促進脂肪動員分解代謝、調(diào)節(jié)胰島素分泌方面發(fā)揮重要作用，以ZAG為干預(yù)靶向無疑將為運動干預(yù)脂代謝異常相關(guān)疾病，如IR及糖尿病等疾病的防治帶來積極的益處。

4?結(jié)論

4.1?耐力運動能夠提高IR大鼠肝臟ZAG和PGC-1α蛋白表達，改善血脂代謝，改善IR狀態(tài)。

4.2?耐力運動中大鼠肝臟ZAG可能通過促進線粒體生物合相關(guān)因子PGC-1α表達而發(fā)揮刺激脂肪分解的作用。

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