郭曉慧 郭雅瓊 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

海鏈藻屬(ThalassiosiraCleve)物種是一類(lèi)常見(jiàn)的海洋浮游硅藻[1,2]。該屬物種多樣性豐富, 目前已報(bào)道了270多個(gè)分類(lèi)單位[3]。海鏈藻個(gè)體微小, 殼面直徑多在20 μm以下, 是海洋微型浮游植物的重要組成部分, 有些還是近岸海域常見(jiàn)的藻華生物[2,4]。

突起(支持突fultoportula、唇形突rimoportula、閉合突occluded process)在海鏈藻的分類(lèi)學(xué)中具有重要應(yīng)用價(jià)值, 各類(lèi)突起的數(shù)目、密度和排列方式是重要的分類(lèi)學(xué)依據(jù)[1,2]。此外, 殼面孔紋排列方式、群體特征、殼緣是否具有肋紋結(jié)構(gòu)、殼面觀和環(huán)面觀形狀、硅質(zhì)化程度、客套高度、環(huán)帶特征、支持突基部圍孔個(gè)數(shù)等特征, 在海鏈藻的分類(lèi)學(xué)中也是重要的參考依據(jù)[1,2]。

海鏈藻屬以往研究多集中于極地(北極水域)和溫帶地區(qū)(北大西洋水域)[2,5,6], 近年研究發(fā)現(xiàn)該屬在熱帶、亞熱帶水域也具有較高的物種多樣性[7],先后報(bào)道了一些新記錄種、新種和新變種, 如艾倫海鏈藻肋紋變種T. alleniivar.striata[8]和小字海鏈藻雙衛(wèi)變種T. minusculavar.bicustodis[9]、狹線形海鏈藻T. anguste-lineata[10]和碟形海鏈藻T. minicosmica[10]、中華海鏈藻T. sinica[11]等。目前我國(guó)已記錄海鏈藻屬物種50余個(gè), 但與我國(guó)遼闊的近海海域而言, 多樣性仍較為有限[11]。為了明確海鏈藻屬的物種多樣性, 基于形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù),本文報(bào)道了我國(guó)廣東大亞灣水域海鏈藻屬的一個(gè)新物種： 扇形海鏈藻Thalassiosira flabellatasp. nov.X.H. Guo, Y.Q. Guo & Y. Li。

1 材料與方法

1.1 單克隆培養(yǎng)株系的建立

采集活體樣品帶回實(shí)驗(yàn)室, 在倒置顯微鏡下挑取目標(biāo)藻細(xì)胞, 建立培養(yǎng)株系[11]。本文于2015年3月對(duì)采自于廣東大亞灣(22°41′52.4″ N, 114° 34′22.1″E)的活體樣品進(jìn)行藻株分離, 建立了6個(gè)扇形海鏈藻單克隆株系, 分別為： MC324、MC326、MC327、MC328、MC329和MC330。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察與分子系統(tǒng)學(xué)分析

吸取0.1 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液, 滴于載玻片上并加蓋蓋玻片, 用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)進(jìn)行微分干涉(Differential interference contrast, DIC)觀察[11]。另外, 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液1 mL, 酸化去除有機(jī)質(zhì)后, 用蒸餾水水洗至中性。吸取適量酸化后的樣品, 過(guò)濾至孔徑3 μm的Millipore濾膜上, 自然晾干后用碳導(dǎo)電膠貼于SEM樣品銅臺(tái)上, 濺射儀噴金后置于掃描電鏡(Zeiss Ultra 55)下進(jìn)行觀察和拍照[11]。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞, 提取總DNA。擴(kuò)增核糖體小亞基編碼基因(Small subunit ribosomal encoding gene, SSU)和大亞基編碼基因(Large subunit ribosomal encoding gene, LSU)的D1-D3區(qū)的序列。使用BioEdit軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和矩陣[12], 用MrBayes 3.2構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)樹(shù)(Bayesian inference,BI)[11]。

2 結(jié)果

2.1 基于形態(tài)學(xué)特征的初步鑒定

經(jīng)過(guò)光鏡和掃描電鏡的觀察, 發(fā)現(xiàn)本文建立的6個(gè)單克隆培養(yǎng)株系具有典型海鏈藻物種一個(gè)中央支持突、一圈殼緣支持突和一個(gè)殼緣唇形突的特征, 但支持突形狀與位置、群體特征和殼面孔紋排列方式又區(qū)別于已報(bào)道的海鏈藻物種。

2.2 基于核糖體SSU和LSU序列的系統(tǒng)學(xué)分析

SSU rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 1)顯示, 扇形海鏈藻與凹面海鏈藻T. concaviuscula、矮小短棘藻Detonula pumila聚集在一個(gè)小分支上, 并且具有較高的置信值(BPP＞0.90)。它們與太平洋海鏈藻T. pacifica和夏眠海鏈藻T. aestivalis聚在一起形成一個(gè)獨(dú)立的分支。扇形海鏈藻與凹面海鏈藻有25個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.014; 與矮小短棘藻有39個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.019; 與太平洋海鏈藻有41個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.020; 與夏眠海鏈藻有41個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.020。

而基于LSU rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)則有所不同(圖 2), 扇形海鏈藻和三眼小盤(pán)藻Minidiscus trioculatus(Taylor) Hasle聚在一起, 然后與諾氏海鏈藻T.nordenskioeldii、極小海鏈藻T. minima和旋鏈海鏈藻T. curviseriata形成姐妹支(BPP＞0.90)。扇形海鏈藻與三眼小盤(pán)藻有29個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.045; 與諾氏海鏈藻有26個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.041; 與極小海鏈藻有25個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.034; 與旋鏈海鏈藻有31個(gè)堿基差異, 遺傳距離為0.045。

2.3 新物種的確認(rèn)

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù), 支持本文所建立的6個(gè)株系為海鏈藻屬一新種。

扇形海鏈藻Thalassiosira flabellataX. H. Guo,Y. Q. Guo & Yang Li sp. nov. 圖版 Ⅰ

Description： Cells solitary or in short chains,rectangular in girdle views. Gourd-shaped chloroplasts. Valves circular and flat, 6—10 μm in diameter.Areolae arranged into fascicles, 39—49 in 10 μm.Normal areolae and tiny siliceous spines on valve mantle. A central fultoportula with short tube-like extension externally, surrounded by 3 satellite pores internally. A marginal ring of fultoportulae keeping 2—3 areolae away from the valve margin, 4—7 in 10 μm,with 3 satellite pores internally. A rimoportula within the marginal ring of fultoportulae.

Holotype： Permanent slide of strain MC328 deposited at the Laboratory of phycology, College of Life Science, South China Normal University, China,catalog number PS37. Fixed samples of strain MC328 deposited in the same place, as F-MC328.

Type locality： Daya bay (22°41′52.4″ N, 114°34′22.1″E), Guangdong Province, South China Sea,P. R. China.

Habitat： Marine, planktonic.

Etymology： The name “flabellata” represents the areolae pattern on the valve face.

Live strain： MC324 deposited in the Laboratory of Phycology, School of Life Science, South China Normal University, China.

葉狀色素體多數(shù), 分布于殼緣處(圖版Ⅰ-a—b)。細(xì)胞可形成鏈狀群體(圖版Ⅰ-a), 也可單個(gè)生活(圖版Ⅰ-b)。環(huán)面觀呈四邊形(圖版Ⅰ-a), 貫殼軸2—3 μm; 殼面觀圓形(圖版Ⅰ-b), 直徑6—10 μm。殼面孔紋束狀排列(圖版Ⅰ-c—d), 密度為10 μm內(nèi)39—49個(gè)。殼面中央處有1個(gè)支持突, 基部有3個(gè)圍孔(圖版Ⅰ-c—f), 并與1個(gè)中央大孔緊密相鄰(圖版Ⅰ-e—f), 中央支持突具有外管結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ-e)。殼面邊緣有1圈支持突(圖版Ⅰ-c—d), 基部有3個(gè)圍孔(圖版Ⅰ-i), 密度為10 μm內(nèi)4—7個(gè)。殼緣支持突外管呈圓柱形, 基部可見(jiàn)有1圈明顯的硅質(zhì)壁(圖版4-g)。有1個(gè)唇形突, 位于1圈殼緣支持突內(nèi), 緊鄰(圖版Ⅰ-g)或略微偏離(圖Ⅰ-h) 1個(gè)殼緣支持突。唇形突外管與殼緣支持突外管幾乎等長(zhǎng)(圖版Ⅰ-g、j)。殼面硅質(zhì)化弱, 殼套處硅質(zhì)化較重, 孔紋之間有明顯的硅質(zhì)增厚, 還散布著硅質(zhì)小刺(圖版Ⅰ-g、i)。殼套高度為2—3個(gè)孔紋(圖版Ⅰ-j), 密度為10 μm內(nèi)54—74個(gè)。

本文僅見(jiàn)殼環(huán)帶結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ-j), 其約四分之一的寬度是無(wú)孔區(qū), 其余則分布有孔紋?？准y大小不一, 靠近殼緣處有1行規(guī)則排列的大孔, 密度是10 μm內(nèi)65—72個(gè)。

生境： 海洋浮游生活。

分布： 標(biāo)本采自惠州大亞灣(3月)。

新種詞源學(xué)： 殼面孔紋束狀排列為新種的典型特征, 故取名為扇形海鏈藻T. flabellata。

模式標(biāo)本產(chǎn)地： 廣東大亞灣(22°41′52.4″ N, 114°34′22.1″E)。

模式標(biāo)本保存地： MC328株系的永久玻片和固定樣保存在廣東華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室, 標(biāo)本玻片的編號(hào)為PS37。

圖 1 基于核糖體小亞基SSU nrDNA構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)樹(shù)Fig. 1 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of SSU of the nuclear rDNA

3 討論

3.1 扇形海鏈藻與相似種的形態(tài)學(xué)比較研究

扇形海鏈藻具有典型海鏈藻物種的特征： 一個(gè)中央支持突、一圈殼緣支持突和一個(gè)殼緣唇形突。具有這一特征的還有艾倫海鏈藻T. allenii、柔弱海鏈藻T. tenera、微小海鏈藻T. exigua、深?yuàn)W海鏈藻T. profunda、帕爾海鏈藻、海氏海鏈藻T. has-leae、太平洋海鏈藻、夏眠海鏈藻等物種[2]。但是它們之間的孔紋排列方式又不盡相同, 艾倫海鏈藻呈切線狀或偏心狀排列、柔弱海鏈藻和微小海鏈藻呈直線列狀排列、深?yuàn)W海鏈藻呈不明顯輻射狀排列、海氏海鏈藻呈放射狀或不完全的線形排列、太平洋海鏈藻呈切線狀排列、夏眠海鏈藻呈放射狀排列[2]。其中扇形海鏈藻和帕爾海鏈藻的殼面孔紋排列成扇形或束狀, 使之顯著區(qū)別與其他相似物種。扇形海鏈藻與帕爾海鏈藻的區(qū)別在于： 扇形海鏈藻殼面支持突和唇形突均具有外管, 而帕爾海鏈藻的突起沒(méi)有外管, 只有內(nèi)管; 其次, 扇形海鏈藻殼面平, 而帕爾海鏈藻的殼面隆起呈鼓狀; 第三,扇形海鏈藻的中央支持突具有3個(gè)圍孔, 而帕爾海鏈藻具有4—5個(gè)圍孔。

圖 2 于核糖體大亞基LSU nrDNA D1-D3構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)樹(shù)Fig. 2 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of LSU of the nuclear rDNA

殼面孔紋束狀排列的特征在其他一些海鏈藻物種也具有報(bào)道, 例如細(xì)弱海鏈藻T. subtilis、雙環(huán)海鏈藻T. diporocyclus、小字海鏈藻T. minuscula、斑點(diǎn)海鏈藻T. punctigera、倫德海鏈藻T. lundiana、安達(dá)曼海鏈藻T. andamanica、管狀海鏈藻T.tubifera、碟形海鏈藻T. minicosmica等。但是它們之間的區(qū)別特征也十分明顯：(1)細(xì)弱海鏈藻、雙環(huán)海鏈藻、小字海鏈藻、斑點(diǎn)海鏈藻、碟形海鏈藻和安達(dá)曼海鏈藻均可形成膠質(zhì)狀群體, 而扇形海鏈藻則未見(jiàn)膠質(zhì)群體; (2)斑點(diǎn)海鏈藻、管狀海鏈藻和倫德海鏈藻具有閉合突, 而扇形海鏈藻則無(wú); (3)上述大部分海鏈藻的殼面均分布有支持突, 而扇形海鏈藻、斑點(diǎn)海鏈藻和碟形海鏈藻不具有這一特征;(4)細(xì)弱海鏈藻、雙環(huán)海鏈藻、小字海鏈藻的殼緣支持突無(wú)外管, 而扇形海鏈藻則有明顯的外管?？傮w而言, 上述海鏈藻物種的相似特征彼此重疊, 需要運(yùn)用多重特征的對(duì)比, 才能準(zhǔn)確區(qū)分。

3.2 海鏈藻的分子系統(tǒng)學(xué)研究

核糖體小亞基SSU和大亞基LSU序列是硅藻研究中應(yīng)用較多的目標(biāo)基因, 在多個(gè)疑難類(lèi)群的分類(lèi)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用, 如骨條藻屬Skeletonema[13]、角毛藻屬Chaetoceros[14,15]等。SSU首先被應(yīng)用于海鏈藻科的系統(tǒng)學(xué)研究, 顯示海鏈藻屬應(yīng)該是多系起源而不是1個(gè)自然類(lèi)群[16]。本文基于SSU和LSU的系統(tǒng)學(xué)分析, 也再次驗(yàn)證了這一結(jié)論, 或許預(yù)示著現(xiàn)存海鏈藻屬應(yīng)該是由幾個(gè)獨(dú)立屬構(gòu)成。雖然基于SSU和LSU的系統(tǒng)學(xué)分析均支持海鏈藻屬是多系起源, 但是并未清晰顯示其下各個(gè)小類(lèi)群的劃分, 因此目前仍不能建立統(tǒng)一的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。在本文研究中, 扇形海鏈藻在SSU和LSU系統(tǒng)樹(shù)中的位置并不一致。這也表明核糖體基因在海鏈藻研究中存在一定的局限性。后續(xù)研究需要探索更多的目的基因, 例如葉綠體基因rbcL、線粒體基因COX1、psbC等, 繼而篩選更加適宜于海鏈藻的標(biāo)記基因, 以期有助于海鏈藻屬新的系統(tǒng)學(xué)體系的構(gòu)建。