楊天燕 孟 瑋 高 攀 胡建勇 林紅喜 高天翔

(1. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316022; 2. 新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所, 烏魯木齊 830000;3. 烏魯木齊市百匯魚生漁業(yè)科技有限公司, 烏魯木齊 830026)

魚菜共生(Aquaponics)最早可追溯到1500年前東南亞地區(qū)的稻田養(yǎng)魚, 是一項涉及魚類、微生物和植物三者共營共生的新型復(fù)合耕作技術(shù), 通過系統(tǒng)內(nèi)部可持續(xù)性的物質(zhì)循環(huán)和能量流動, 將水產(chǎn)養(yǎng)殖(Aquaculture)和水耕栽培(Hydroponics)兩種農(nóng)耕技術(shù)有機結(jié)合, 達到魚-菜-菌的和諧互利共生, 從而實現(xiàn)“養(yǎng)魚不換水、種菜不施肥”的高效、清潔、健康的生態(tài)循環(huán)養(yǎng)殖模式[1]。近年來, 在食品安全問題備受關(guān)注的背景下, 魚菜共生健康養(yǎng)殖模式由于其獨特的生態(tài)、環(huán)保和安全優(yōu)勢, 目前已在國內(nèi)外得到廣泛推廣和應(yīng)用[2]。相較傳統(tǒng)的線性池塘養(yǎng)殖模式而言, 在魚菜共生系統(tǒng)中, 魚類排泄物可作為植物營養(yǎng), 而植物代謝作用既可改善水質(zhì)、殘根又可供魚類食用, 微生物作為中間者能夠有效調(diào)節(jié)魚類和植物間的微生態(tài)平衡。新疆作為我國西北典型干旱缺水地區(qū), 為了實現(xiàn)池塘養(yǎng)殖節(jié)水和資源循環(huán)利用, 近年來部分地區(qū)陸續(xù)開展了魚菜共生體系的試驗示范。目前關(guān)于魚菜共生的研究多集中在養(yǎng)殖模式的設(shè)計和優(yōu)化[3—6], 而對于環(huán)境微生物對水質(zhì)調(diào)節(jié)機理方面的研究較少。

細菌作為養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,其群落結(jié)構(gòu)與多樣性組成在水質(zhì)調(diào)節(jié)、疾病控制及維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用, 很大程度影響著水產(chǎn)動物的健康與生存。基因組(Metagenome), 又稱微生物環(huán)境基因組(Microbial Environmental genome)或元基因組, 由美國威斯康辛大學(xué)麥迪遜分校 Handelsman等[7]在前人研究的基礎(chǔ)上于1998年首次提出, 指一定環(huán)境中整個微生物群落所有遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是主要依靠生物信息學(xué)手段, 分析和比較微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及其進化關(guān)系的新型技術(shù)方法,目前對宏基因組測序主要包括16S rRNA和全基因組測序兩種方法[8], 其中16S rRNA作為揭示生物物種的特征核酸序列, 具有大小適中且突變率小的特點, 被認(rèn)為是最適合細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)[9,10]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 尤其是高通量測序技術(shù)的研發(fā)及應(yīng)用, 為微生物分子生態(tài)學(xué)的研究策略注入了新的力量, 并逐漸成為研究微生物群落多樣性的首選實驗手段[11—13]。

本文以新疆水生野生動物救護中心和烏魯木齊市米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘為研究對象, 基于宏基因組學(xué)的方法, 采用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù), 從環(huán)境微生物角度探討魚菜共生系統(tǒng)中環(huán)境微生物和根系微生物群落組成差異及多樣性水平, 以期為科學(xué)地解釋魚菜共生養(yǎng)殖模式水質(zhì)調(diào)節(jié)機理, 以及池塘養(yǎng)殖水體生物調(diào)控技術(shù)的推廣與應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗地點概況

實驗地點位于新疆水生野生動物救護中心和烏魯木齊市米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地兩處環(huán)境條件類似的標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖池塘。池塘面積0.43 hm2,平均水深1.80 m, 具有獨立的進排水系統(tǒng), 水源為地下深井水, 水質(zhì)符合GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn), 2017年5月18日放養(yǎng)品種為80—100 g/尾的大規(guī)格羅非魚魚種, 放養(yǎng)量為15000尾/hm2。

1.2 浮床制作及蔬菜移植

池塘水面架設(shè)直徑為75 mm的PVC排水管制作的浮床, 浮床規(guī)格為360 cm×120 cm。聚乙烯網(wǎng)片分上下兩層包裹浮床, 其中上層為疏網(wǎng), 網(wǎng)眼直徑3 cm; 下層為密網(wǎng), 網(wǎng)眼直徑0.8 cm。網(wǎng)片用塑料扎帶繃緊, 上下網(wǎng)片形成2—3 cm的間距。2017年6月中旬, 剪取長度為15 cm提前在菜地育成的空心菜莖稈, 使用扦插法將其按10 cm株距插入浮床網(wǎng)片中?？招牟饲o桿露出下層網(wǎng)片約3—4 cm。將移植好空心菜的浮床用繩子串聯(lián), 分8行排布于池塘下風(fēng)處, 每行12個, 共計96個。浮床面積共計415 m2,覆蓋率約為池塘養(yǎng)殖面積的10.4%。經(jīng)過一定時間的生長, 待空心菜長至30 cm時開始采摘, 15d左右采摘1次。烏魯木齊市米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘在整個養(yǎng)殖期空心菜共收獲5茬,總產(chǎn)量6250 kg, 單產(chǎn)15.1 kg/m2, 而新疆水生野生動物救護中心魚菜共生池塘空心菜生長狀況較差, 未能形成采摘規(guī)模(圖 1)。

1.3 樣品采集及DNA提取

圖 1 空心菜長勢情況Fig. 1 The growth of water spinach in different ponds

表 1 樣品信息Tab. 1 Sampling information

除兩處魚菜共生池塘外, 另各自選取1口未架設(shè)生物浮床的普通池塘作空白對照, 2017年9月10日分別采集水樣進行實驗, 采集信息詳見表 1。每口池塘隨機選取8個取樣點, 采集距離水面約15 cm深處的10 mL等體積水樣, 均勻混合后裝入滅菌塑料螺口離心管。將隨機剪取的空心菜根系懸浮于PBS緩沖液(0.15 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Na2EDTA,pH 8.0)中, 充分搖勻后使用孔徑0.22 μm (Millipore)無菌濾膜對水樣進行過濾, 并將濾膜剪碎置于無菌冷凍管中。上述所有樣品均置于-20℃保存。采用CTAB法[14]對水樣基因組DNA進行提取, 紫外分光光度法檢測DNA純度和濃度, 并取適量的DNA樣品于離心管中, 使用無菌水稀釋至1 ng/μL備用。

1.4 PCR擴增及產(chǎn)物回收

以稀釋后的基因組DNA為模板, 針對細菌16S rRNA的V3—V4雙可變區(qū)域, 使用帶Barcode的特異引物338F/806R進行擴增, 引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。使用New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer和高保真聚合酶進行PCR。50 μL PCR反應(yīng)體系為： 2×Phusion GC buffer 25 μL, 正反向引物各2.5 μL(10 μmol/L), 模板DNA 15 ng, 加去離子水至終體積至50 μL。PCR反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性3min; 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 30個循環(huán); 最后72℃延伸10min。使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測, 使用QIAgen公司的QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒對目的條帶進行回收, 并送至陜西博瑞德生物科技有限公司測定。

1.5 文庫構(gòu)建及高通量測序

使用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量, 合格后使用Illumina Hiseq 2500 PE250測序平臺進行高通量測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)分析

在截去Barcode和引物序列后, 使用FLASH1.2.11軟件[15]對每個樣品的reads進行拼接, Qiime1.7.0軟件[16]對拼接后的數(shù)據(jù)(Raw Tags)進行過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(CleanTags)。使用UCHIME 4.1基于Gold database數(shù)據(jù)庫比對后去除嵌合體序列[17]。Uparse7.0.1001軟件[18]對最終有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)進行聚類, 將相似性大于97%的序列定義為OTUs (Operational Taxonomic Units)。篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表, 采用 Mothur方法與SILVA[19]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[20]進行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8—1.0)。

采用MUSCLE3.8.31軟件[21]對OTUs進行序列比對, Qiime1.7.0軟件計算Unifrac距離并構(gòu)建UPGMA聚類樹, 并同時計算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD_whole_tree等多樣性參數(shù)。基于R語言軟件繪制樣品稀釋曲線, 并進行Alpha多樣性指數(shù)的組間差異分析和無度量多維標(biāo)定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 樣品測序質(zhì)量及復(fù)雜度分析

6個樣品得到的原始序列為56444條, 用于構(gòu)建OTU分類信息單元且獲得注釋信息的平均tags數(shù)(Taxon Tags)為53421條, 有效數(shù)據(jù)量達到94.64%。在相似度大于97%的水平上檢測到OTU平均數(shù)為945 (圖 2)。

稀釋曲線(Rarefaction Curve)是常見的用于描述組內(nèi)樣品多樣性的曲線, 可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性, 并間接反映樣品中物種的豐富程度。對樣品隨機抽樣, 以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)構(gòu)建稀釋曲線如圖 3所示, 當(dāng)隨機抽取的測序數(shù)量大于30000條時, 曲線趨向平坦, 表明測序數(shù)據(jù)量漸進合理, 更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTU邊際貢獻率較小。而當(dāng)測序數(shù)量相同時, 細菌群落OTU數(shù)量表現(xiàn)為JH.KX＞JH.C＞MD.C＞JH.R＞MD.R＞MD.KX,表明JH.KX微生物豐度明顯高于其他樣品。Rank Abundance曲線(圖 4)直觀的反映了樣品中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上曲線跨度較大, 表明物種的豐富度較高; 而在垂直方向上曲線平滑程度較小, 表明測定樣品中物種的均勻程度相對較低。

2.2 細菌微生物群落組成

根據(jù)物種注釋結(jié)果, 選取每個樣品在各分類水平上最大豐度排名前10的物種, 繪制物種相對豐度柱狀圖, 以門(Phylum)的水平為例繪制物種相對豐度柱狀圖如圖 5所示, 分別為柔膜菌門(Tenericutes)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、藍菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和未分類菌群(Others)。從門分類水平上細菌相對豐度變化趨勢來看, 除MD.R (23.86%)以外, 其余樣品中檢測到的優(yōu)勢菌群主要為變形菌門(Proteobacteria), 所占比例均在49%以上, 其中JH.R高達85.84%。柔膜菌門(Tenericutes)在JH.C、MD.R和MD.KX中均未檢測到。實驗組水環(huán)境微生物群落(JH.KX和MD.KX)中擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍菌門(Cyanobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)相對豐度均高于各自對照組(JH.C和MD.C), 而疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對豐度均明顯低于其對照組; 在實驗組空心菜根系微生物群落(JH.R和MD.R)中, JH.R微生物群落中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度顯著偏高, 而MD.R擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占絕對優(yōu)勢, 比例分別為29.60%和35.79%。

從空心菜長勢情況來看, 烏魯木齊市米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘空心菜長勢較好, 無論其根系水樣(MD.R)還是池塘水樣(MD.KX)中, 厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)細菌占比均高于新疆水生野生動物救護中心魚菜共生池塘。在兩處無空心菜生長的池塘中, 擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌占比均低于種植空心菜池塘、疣微菌門(Verrucomicrobia)細菌占比均高于種植空心菜池塘。

對每個分組的物種分類結(jié)果, 篩選特別關(guān)注的物種(默認(rèn)選擇最大相對豐度前10的屬)進行物種分類樹統(tǒng)計(圖 6)[22]。圖中扇形面積的大小代表分組在該分類上相對豐度的比例, 下方數(shù)字表示所有分組在該分類上的平均相對豐度百分率, 前者表示占所有物種的百分率, 后者表示占所選取物種的百分率。從目的水平上來看, MD.R樣品中占優(yōu)勢地位的為擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)的擬桿菌目(Bacteroidales)和厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)的梭菌目(Clostridiales);JH.R樣本中大量檢測到變形菌門(Proteobacteria)、變形菌綱(Alphaproteobacteria)的根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)以及γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的氣單胞菌目(Aeromonadales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)的類群, MD.KX的優(yōu)勢菌群來自于藍菌門(Cyanobacteria/Chloroplast); 紅螺菌目(Rhodospirillales)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)細菌在JH.C中占優(yōu)勢。

根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果和研究需求, 當(dāng)樣品數(shù)大于5時, 對所有樣品進行均一化處理, 分析不同樣品之間共有和特有的OTU并繪制花瓣圖(圖 7)。從圖中可以直觀的看出不同樣品OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況, 6個樣品共有的OTU數(shù)目為165, 不同樣品中特有OTU表現(xiàn)為JH.KX最高(137), JH.R最低(30), 而MD.R和JH.C數(shù)量相同, 均為85。

2.3 樣品復(fù)雜度分析

圖 2 各樣品的OTUs聚類和注釋情況統(tǒng)計Fig. 2 OTUs clustering and annotation statistics of each sample

圖 3 樣品的稀釋曲線圖Fig. 3 Rarefaction curve of water samples

圖 4 樣品的Rank Abundance曲線圖Fig. 4 Rank Abundance curve of water samples

圖 5 門水平上的物種相對豐度柱狀圖Fig. 5 Relative abundance histogram of species on Phylum level

Alpha多樣性分析 Alpha多樣性主要關(guān)注局域生境或樣品內(nèi)(Within-community)的微生物群落多樣性[23], 通過單樣本的多樣性分析可以反映樣品內(nèi)的微生物群的豐富度和多樣性, 進而評估各樣品中微生物群落的物種豐富度和多樣性的差異。序列相似度大于97%的情況下可聚類成一個OTU,通常被認(rèn)為是源自同一個種(Species boundary)。利用Mothur軟件對不同樣品在97%相似度閾值下的多樣性進行分析, 為排除因樣本測序數(shù)量不同而造成的誤差, 以序列最少的樣品序列數(shù)為基準(zhǔn), 分別進行10次抽樣重復(fù), 所得的Alpha多樣性指數(shù)取平均值如表 2所示。分析表明, 所有取樣點的多樣性測序結(jié)果Coverage均高于99%, 表明測序結(jié)果覆蓋度好且具有較高可信度, 能夠代表樣本的真實情況。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是反映物種豐富度和均勻度的2個重要參數(shù), 其值越大表明個體分配越均勻、群落多樣性越高, 從表 2可以看出, 6個水樣菌落的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)排序分別為JH.KX＞MD.C＞JH.C＞MD.KX＞MD.R＞JH.R和JH.KX＞MD.C＞MD.KX＞JH.C＞JH.R＞MD.R, 結(jié)果表明空心菜根系水樣(MD.R和JH.R)中細菌微生物群落多樣性相對較低。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是生態(tài)學(xué)中用于估算樣本物種豐度的常用指數(shù), 本研究中二者的變化趨勢大體一致, 均表現(xiàn)為JH.KX值最大、MD.KX最低, 表明前者中含有的OTU數(shù)目最多, 即細菌種類數(shù)量最多、群落的豐度也最高, 而后者豐度最低。

無度量多維標(biāo)定法分析 無度量多維標(biāo)定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS)統(tǒng)計是一種將多維空間樣本簡化到低維空間進行數(shù)據(jù)分析的方法, 能夠很好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)[24,25]。NMDS統(tǒng)計結(jié)果以點的形式反映在多維空間上, 各樣點間的距離體現(xiàn)了彼此差異程度, 距離越近代表相似度越高。基于OTU水平的NMDS排序結(jié)果見圖 8, 從圖中可以看出在排序的脅強系數(shù)(Stress, S)小于0.001的情況下, JH.KX與JH.C差異最小, JH.R和MD.R位于第一象限, MD.KX和MD.C分別位于第二和第四象限。

2.4 聚類分析

為了進一步得到不同樣品間群落結(jié)構(gòu)差異, 對OTU進行多序列比對并基于Weighted Unifrac距離矩陣構(gòu)建非加權(quán)組平均聚類樹(Unweighted Pairgroup Method with Arithmetic Mean, UPGMA), 并將聚類結(jié)果(左側(cè))與各樣品在門水平上的物種相對豐度分布(右側(cè))整合展示, 結(jié)果如圖 9所示, JH.KX與JH.C相似度最高, 與NMDS分析結(jié)果類似。MD.R與其他樣品間距離最遠, 相似度最低。

3 討論

3.1 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

從各組細菌物種分類樹可以看出, JH樣本中占絕對優(yōu)勢的細菌主要來自變形菌門(Proteobacteria),其中來自于空心菜根系樣本JH.R的根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、氣單胞菌目(Aero-monadales)和交替單胞菌目(Alteromonadales)占優(yōu)勢。促生菌是一類具有固氮、溶磷、解鉀、解硫、硝化、反硝化等作用, 參與無機鹽循環(huán)或能產(chǎn)生植物激素直接或間接促進植物生長的菌[26]。氮循環(huán)是魚菜共生系統(tǒng)的核心過程, 長期以來科研界普遍認(rèn)為微生物對植物生長的促進作用主要體現(xiàn)在固氮作用和磷轉(zhuǎn)化[27]。其中與固氮作用密切相關(guān)的根瘤菌是一類與豆科植物根系共生, 形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養(yǎng)的革蘭氏陰性細菌, 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和固氮生態(tài)體系中起著極其重要的作用[28]。按照J(rèn)ordan在1984年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》中分類標(biāo)準(zhǔn), 將根瘤菌目劃分為四個科, 分別為： 慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、葉桿菌科(Phyllobacteriaceae)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)[29]。有研究發(fā)現(xiàn), 根瘤菌可侵入非豆科植物根內(nèi), 對促進植物生長有益, 尤其是對某些水生植物, 如水稻的生長和增產(chǎn)大有幫助[30]。王旭明[31]通過研究證實, 空心菜對污水中氮、磷的去除率分別可達87.36%和76.4%, 石焱等[32]通過大規(guī)模養(yǎng)殖試驗表明人工浮床水培水雍菜對池塘養(yǎng)殖廢水中氨氮、總氮和總磷有良好的去除效果。在本實驗中空心菜根系樣本中檢測到根瘤菌的存在, 推測其改變了根系對無機營養(yǎng)鹽和礦物質(zhì)吸收的生理活動, 從而促進空心菜的生長。此外, 鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)中包含的新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)可以降解芳香族化合物, 如苯酚、苯胺、硝基苯和菲[33], 這些細菌有利于改善水質(zhì)、降低有機物污染,促進水生植物生長, 降低水中魚類受這些化合物的污染, 從而改善水產(chǎn)品質(zhì)。然而, JH.R中假單胞菌目(Pseudomonadales)所包含的魚類致病菌Pseudomonas anguilliseptica數(shù)量明顯高于MD.R, 可能干擾了魚類的正常代謝[34], 其負面影響高于益生菌的作用, 影響了空心菜的生長, 這可能是新疆水生野生動物救護中心魚菜共生池塘空心菜生長較差一個重要原因。另外, 從池塘水質(zhì)理化數(shù)據(jù)來看, pH(9.26)高于米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘(8.05), 這對于喜中偏酸性環(huán)境的空心菜而言, 不利于其生長。而氨氮、鈣、鎂含量(0.525、25.2和7.462 mg/L)明顯低于后者(0.834、125.94和46.056 mg/L), 這些營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏也使得空心菜長勢較差。

圖 6 各分組中特定物種分類樹Fig. 6 Species taxa tree in each group

圖 7 基于OTUs繪制的花瓣圖Fig. 7 Petal graph based on OTUs

3.2 水質(zhì)條件和細菌多樣性的關(guān)系

米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地池塘樣本中獨有且占優(yōu)勢的類群為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和藍菌門(Cyanobacteria), 其中前兩者在根系中占優(yōu)勢。擬桿菌門(Bacteroidetes)涵蓋了三大類革蘭氏陰性菌, 即非孢子形成菌、厭(需)氧菌和桿狀細菌, 它們廣泛分布在土壤、沉積物和海水環(huán)境中, 以及動物的內(nèi)臟和皮膚中。厚壁菌門(Firmicutes)下的Proteocatella屬, 包含一些厭氧耐寒的細菌[35], 這些細菌在冬季溫度較低時仍能夠改變池塘水質(zhì)。藍菌門(Cyanobacteria)的藍藻類是產(chǎn)生水華的主要原因, 也是水體富營養(yǎng)化的征兆[36,37], 推測這可能是米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地池塘中空心菜生長較好的原因之一, 此外, 空心菜的生長有利于凈化水質(zhì), 消除富營養(yǎng)化,利于水中魚類的生存。JH.R和MD.R二者共有的細菌類群為氣單胞菌目 (Aeromonadales)和交替單胞菌目(Alteromonadales), 氣單胞菌目下的氣單孢菌屬(Aeromonas)普遍存在于淡水和半咸水中[38]。交替單胞菌目下的希瓦氏菌屬(Shewanella), 大部分發(fā)現(xiàn)于溫度較低的水體中[39], 這與西北地區(qū)水體溫度較低的狀況相一致。希瓦氏菌屬(Shewanella)常用于環(huán)境的生物修復(fù), 能夠降低水中有毒物質(zhì)和重金屬的毒性, 從而提高生物浮床系統(tǒng)對污染物的去除效率。

圖 8 不同樣本的NMDS排序圖Fig. 8 NMDS ordination diagram of samples

表 2 微生物群落多樣性指數(shù)Tab. 2 Diversity indices of different microbial communities

圖 9 基于Weighted Unifrac距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹Fig. 9 The UPGMA phylogenetic tree constructed based on Weighted Unifrac distance

3.3 細菌組成對水培蔬菜生長的影響

門水平上的物種豐度圖顯示MD.R樣本中來自于變形菌門(Proteobacteria)、藍菌門(Cyanobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的細菌占優(yōu)勢, 且分布均勻, 占比相差不大。與其他組比較, 前者明顯偏低, 而后兩者明顯偏高。有研究證實, 種植基質(zhì)中微生物組成多樣性越高、群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜, 越能促進植物的生長, 單一細菌與真菌菌群對植物生長甚至產(chǎn)生抑制作用[40]。從本實驗的結(jié)論以及現(xiàn)場抽樣檢測來看, 來自于米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘的空心菜長勢較好, 與其根系細菌分布均勻度呈正相關(guān)。這表明植株根際附近微生物生理活動更為活躍, 各種代謝功能也更為頻繁。

從花瓣圖中特有OTU可以看出, 種植空心菜的水樣中的OTU數(shù)量最多, 明顯高于未種植空心菜水樣。水培蔬菜不僅增加水體的溶解氧含量, 根系還為微生物的生長和繁殖提供了場所, 其分泌物能促進某些固氮細菌、嗜磷細菌的生長, 降低水體中含氮化合物的濃度、改善養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡[41],與此同時, 植物根際微生物數(shù)量的增加, 在其周圍構(gòu)建起一個物理屏障保護了植物根系, 從而減少病原菌和蟲害的入侵。本研究結(jié)果證實了水培植物的種植有利于池塘水體中細菌微生物生長, 而這些共生細菌的存在反過來也極大地促進了蔬菜的生長。

對比兩處試驗點空心菜根系上特有OTU, 發(fā)現(xiàn)米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地魚菜共生池塘空心菜根系(MD.R)中特有OTU明顯高于新疆水生野生動物救護中心(JH.R), 而這些特有OTU可能與該池塘空心菜生長較好有關(guān)。劉志敏等[42]通過研究發(fā)現(xiàn), 根際細菌在提高蔬菜對環(huán)境脅迫的抗逆性上有著十分重要的作用, 能有效促進植物的生長。因此, 從某種意義上來講, 蔬菜根際和種植環(huán)境中細菌微生物之間存在相互促進、相互調(diào)節(jié)的作用機制。

NMDS排序圖顯示JH.C與JH.KX處于同一象限, 且相聚最近, 表明兩者微生物群落結(jié)構(gòu)相似, 而MD.C與MD.KX位于不同象限, 顯示兩者微生物群落結(jié)構(gòu)相差較大, 這可能是因為米東區(qū)長山子鎮(zhèn)水源地養(yǎng)殖基地(MD)池塘空心菜生長較旺盛, 對水質(zhì)改善較大, 改變水體細菌結(jié)構(gòu)組成多樣性的程度較高。此外, JH.R和MD.R也處于同一象限, 表明二者存在生長于空心菜根系上的共有細菌。在UPGMA聚類圖中, 魚菜共生池塘水中的細菌與對照水體較為相似, 而與根系上的細菌差別較大也證明了此點。這可能是由于受到根系的影響, 使得植物根際的微區(qū)域環(huán)境與其周圍的環(huán)境主體在物理、化學(xué)和生物方面存在很大差別。