林婧楠 趙景壯 劉 淼 任廣明 盧彤巖 徐黎明

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

鯉春病毒血癥(Spring Virernia of Carp, SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)引起的, 可造成多種鯉科魚(yú)類(lèi)高死亡率的一種病毒病[1]。該病常暴發(fā)于春季, 可引起鯉科魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)食欲減退、行為遲緩、體表發(fā)黑、腹腔積水、皮膚肌肉出現(xiàn)出血點(diǎn)等臨床癥狀。該病我國(guó)動(dòng)物疫病分類(lèi)名錄中的一類(lèi)動(dòng)物疫病, 易感染一齡以上的鯉, 死亡率可達(dá)70%以上[2]。SVCV是典型的彈狀病毒科(Rhabdoriridae), 水泡性病毒屬(Vesiculorius)的單股負(fù)鏈RNA病毒[3]。該病毒編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白, 分別為核蛋白(Nuclear protein, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質(zhì)蛋白(Matrixprotein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)和RNA聚合酶(RNA polymerase, L)等。其中, 糖蛋白因其表面含有抗原決定簇, 具有很強(qiáng)的免疫原性可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。因此,糖蛋白成為現(xiàn)階段SVCV病毒檢測(cè)、抗體制備以及疫苗研制的熱點(diǎn)[4]。根據(jù)糖蛋白基因序列, 可將SVCV分為Ia、Ib、Ic和Id四個(gè)基因型, 我國(guó)SVCV分離株的基因型均為Ia[5]。目前, SVC是我國(guó)水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃的主要疫病之一, 對(duì)于該病尚無(wú)有效的防治方法。

對(duì)于病毒病的防控, 疫苗一直是最理想的選擇。釀酒酵母作為GRAS (Generally recognized as safe)生物, 在生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素且在表達(dá)外源基因時(shí), 對(duì)目的蛋白具有一定程度的折疊以及糖基化的修飾的能力[6]。其作為基因表達(dá)的宿主菌已在疫苗研制方面取得了成功, 第一個(gè)商品化的重組疫苗-乙肝疫苗即來(lái)源于釀酒酵母細(xì)胞[7]。酵母表面展示系統(tǒng)是將目的蛋白編碼基因整合在特定的酵母表面展示載體, 最終將目的蛋白展示于酵母表面的一種真核表達(dá)系統(tǒng), 主要包括a凝集素和α凝集素兩種展示系統(tǒng)[8]。a凝集素展示系統(tǒng)是目前較常用的酵母展示系統(tǒng), 該系統(tǒng)的原理是將目的蛋白基因插入酵母展示載體中Aga2基因下游, 經(jīng)過(guò)半乳糖誘導(dǎo), 酵母細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)目的蛋白-Aga2融合蛋白, 在信號(hào)肽的作用下, 該融合蛋白被運(yùn)送至酵母細(xì)胞外。隨后, Aga2亞基通過(guò)二硫鍵與酵母表面的Aga1亞基相結(jié)合間接的將目的蛋白錨定在酵母細(xì)胞表面[9,10](圖 1)。目前該系統(tǒng)已經(jīng)被Zhao等[11]應(yīng)用到口服疫苗研發(fā)領(lǐng)域, 并且取得了一定的療效。

圖 1 a凝集素酵母表面展示系統(tǒng)Fig. 1 a-agglutinin-based display system

根據(jù)當(dāng)前我國(guó)SVCV基因型, 結(jié)合近年來(lái)我國(guó)北方地區(qū)鯉魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)SVCV的檢出情況, 本研究以基因型為Ia的黑龍江地區(qū)SVCV分離毒株shlj1為研究對(duì)象, 利用a凝集素表面展示系統(tǒng), 成功將G蛋白高效展示于酵母細(xì)胞表面, 旨在為SVCV新型口服疫苗的研制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SVCV-shlj1分離株由本課題組分離保存, 其病毒滴度為106.28TCID50/mL[12]; 鯉上皮瘤細(xì)胞(Epitheliomapapulosum cyprini, EPC)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所曾令兵教授惠贈(zèng); 釀酒酵母EBY100菌株和酵母展示載體pYD1由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所黃倢研究員惠贈(zèng); 鼠抗SVCV G蛋白血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

大腸桿菌(E. coli) DH5α、克隆載體pMD18-T simple、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、DNA Marker DL2000、DL15000購(gòu)自TaKaRa公司, 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司, Goat Anti-Mouse IgG antibody H&L (Cy3)購(gòu)自Abcam公司, 亮氨酸((2R)-2-amino-3, 3-dimethylbutanoic acid)、山梨醇(D-Sorbitol)、醋酸鋰(LiAc)購(gòu)自納川生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)SVCV-shlj1(NCBI登錄號(hào)： KX911973)分離株糖蛋白基因序列, 利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物, 同時(shí)參照pYD1酵母展示載體上的酶切位點(diǎn),分別在上下游引物中插入BamHⅠ(GGATCC)或XhoⅠ(CTCGAG)酶切位點(diǎn), 上游引物F： 5′-GGATCCATGTCTATCATCAGCTACATCGCAT-3′, 下游引物R： 5′-CTCGAGTCAAACGAAGGAC CGCATTTCGTG-3′, 引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成。

1.3 酵母展示載體PYD1-G質(zhì)粒的構(gòu)建

采用Trizol法提取SVCV-shlj1毒株的總RNA[13],利用TaKaRa公司的One Step RT-PCR Kit試劑盒擴(kuò)增G基因, 通過(guò)膠回收試劑盒進(jìn)行回收, 回收產(chǎn)物克隆至pMD18-T simple載體。在轉(zhuǎn)化后, 對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定, 鑒定為陽(yáng)性的單菌落送至測(cè)序公司, 測(cè)序結(jié)果正確的菌液, 提質(zhì)粒命名為pMD18-T-G。將pMD18-T-G和表達(dá)載體pYD1分別用BamHⅠ、XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化、回收, 在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E. coli)DH5α中。待出現(xiàn)菌落后, 挑取單菌落, 進(jìn)行PCR鑒定。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pYD1-G, 同時(shí)進(jìn)行菌種保存。

1.4 酵母感受態(tài)的制備以及電轉(zhuǎn)化

將-80℃凍存的釀酒酵母EBY100在YPD平板中進(jìn)行30℃培養(yǎng)活化, 2—4d后挑取單菌落放入液體培養(yǎng)基, 30℃擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)菌液A600=1.3—1.5時(shí),制備釀酒酵母感受態(tài)[14]。向制備好的EBY100酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入5—10 μg的pYD1-G質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化, 轉(zhuǎn)化后用1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇沖洗電擊杯, 將含有質(zhì)粒的山梨醇洗液放入EP管。經(jīng)30℃孵育1h后, 將山梨醇(含pYD1-G質(zhì)粒)涂布于Minimal Dextrose (含亮氨酸)平板中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

隨機(jī)挑取單菌落, 注明序號(hào), 用10 μL的無(wú)菌水溶解菌體, 采用反復(fù)凍融和水煮的方法對(duì)其破壁。取1 μL處理后的樣品進(jìn)行菌液PCR的鑒定, 利用凝膠電泳觀察條帶大小, 挑選出條帶大小相符的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子, 命名為EBY100-PYD1-G進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.6 EBY100-pYD1-G的誘導(dǎo)表達(dá)

將挑取的陽(yáng)性單菌落接種于含2%葡萄糖YNB-CAA液體培養(yǎng)基中, 30℃培養(yǎng), 直至A600=2—5時(shí), 離心收集菌落(5min, 30000 r/min)并將其懸浮于2%半乳糖YNB-CAA液體培養(yǎng)基中, 使菌液A600=0.5—1。將酵母菌在20℃培養(yǎng), 在0—72h內(nèi),每24h取2 mL樣品4℃保存。

1.7 免疫熒光分析

離心收集誘導(dǎo)0、24h、48h和72h的酵母細(xì)胞(5min, 30000 r/min, 4℃), 用PBS清洗菌體, 加入鼠抗G蛋白抗體(1:1000稀釋)作為一抗, 混勻后, 37℃孵育1h。用PBS再次清洗菌體后, 向其中加入羊抗小鼠G蛋白H&L (Cy3)作為二抗(1:500稀釋), 避光37℃孵育1h后離心。最后用PBS對(duì)菌體進(jìn)行清洗,加入20%甘油(PBS稀釋)重懸菌體, 滴于載玻片中,進(jìn)行免疫熒光鏡檢, 同時(shí)利用Image J軟件分析免疫熒光鏡檢視野(n=10)中陽(yáng)性酵母細(xì)胞比例。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

離心收集誘導(dǎo)0、24h、48h和72h的酵母細(xì)胞(5min, 30000 r/min, 4℃)。用PBS反復(fù)沖洗菌體并重懸, 加入鼠抗血清G蛋白抗體作為一抗(1:1000),孵育1h, PBS洗3次, 再加入羊抗小鼠G蛋白H&L(Cy3)作為二抗(1:500)孵育1h, PBS洗3次, 用500 μL PBS重懸菌液, 利用BD FACS Aria II流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 糖蛋白酵母展示系統(tǒng)pYD1-G質(zhì)粒構(gòu)建

以SVCV-shlj1為模板, F和R分別為上下游引物, 利用TaKaRa公司的One Step RT-PCR Kit擴(kuò)增SVCVG基因, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析, 結(jié)果顯示為單一特異性條帶, 與目的基因大小相符(1530 bp,圖 2)。選擇測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒, 利用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)將G基因連接至酵母展示載體pYD1, 對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示菌液PCR產(chǎn)物與目的基因大小相符(圖 3),將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pYD1-G。

圖 2 G基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 2 PCR of G gene

2.2 酵母的電擊轉(zhuǎn)化及鑒定

將pYD1-G質(zhì)粒和pYD1電轉(zhuǎn)入酵母EBY100感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于Minimal Dextrose (含亮氨酸)的選擇培養(yǎng)基中, 30℃培養(yǎng)直至產(chǎn)生單菌落, 挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定, 結(jié)果顯示出現(xiàn)了與目的條帶大小相符合的單一特異性條帶(1530 bp, 圖 4), 陽(yáng)性重組子命名為EBY100-pYD1-G。

2.3 重組酵母免疫熒光檢測(cè)

將誘導(dǎo)0、24h、48h和72h的酵母菌體離心進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)以鑒定SVCV G蛋白的酵母表面展示情況。結(jié)果顯示, 在2%半乳糖誘導(dǎo)下, EBY100-pYD1-G出現(xiàn)特異性的紅色熒光, 并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng), 紅色熒光酵母細(xì)胞所占比例不斷增加,而陰性對(duì)照組(誘導(dǎo)0)未見(jiàn)任何特異性紅色熒光。利用Image J軟件對(duì)免疫熒光鏡檢視野(n=10)進(jìn)行分析可知, 誘導(dǎo)0、24h、48h和72h陽(yáng)性酵母細(xì)胞所占比例平均值分別為8.38%、24.20%、55.30%和72.41%, 且各組之間陽(yáng)性酵母比例差異顯著(P＜0.05, 圖 5)。

圖 3 pYD1-G重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定Fig. 3 PCR identification of pYD1-G recombinant plasmid

圖 4 EBY100-pYD1-G菌液PCR鑒定Fig. 4 PCR identification of yeast EBY100 transformed with pYD1-G

2.4 重組酵母的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

將誘導(dǎo)不同時(shí)間的酵母細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)以鑒定SVCV G蛋白的酵母表面表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果顯示, 誘導(dǎo)0、24h、48h和72h時(shí), 酵母細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度分別為2112、7086、10236和10554。由此可知, 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加, 酵母細(xì)胞表面G蛋白含量隨之增加, 因此體現(xiàn)在熒光強(qiáng)度的逐漸增加。但是, 與誘導(dǎo)48h的酵母細(xì)胞相比較, 當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至72h時(shí), 酵母熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著增加(P＞0.05), 而其余各組均存在顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

G蛋白是SVCV病毒粒子表面糖蛋白, 具有多個(gè)抗原決定簇, 是當(dāng)前疫苗研制、抗體制備研究的熱點(diǎn)[4]。目前已報(bào)道幾種比較成功的魚(yú)類(lèi)彈狀病毒的DNA疫苗均以G蛋白為研究對(duì)象。如張奇亞等[14]分別用G基因與N基因構(gòu)建鱖彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)的DNA疫苗, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有G基因的DNA疫苗保護(hù)率顯著高于含N基因的DNA疫苗; Emmenegger等[16]和Kanellos等[17]利用SVCV G蛋白也構(gòu)建出了具有良好保護(hù)效果的DNA疫苗。因此, 本研究直接選用SVCV的G蛋白為靶蛋白進(jìn)行酵母細(xì)胞表面展示。

釀酒酵母作為真核細(xì)胞生物, 有類(lèi)似高等生物的翻譯后修飾機(jī)制, 能夠?qū)Ξ愒吹鞍自诒磉_(dá)后進(jìn)行糖基化、二硫鍵的異構(gòu)化等翻譯后的修飾及加工[18]。此外, 酵母是公認(rèn)的益生菌, 其細(xì)胞壁中的β-葡聚糖和甘露糖蛋白具有免疫佐劑的功效, 在對(duì)機(jī)體安全無(wú)毒的前提下, 可提高機(jī)體的非特異性免疫, 更好地發(fā)揮疫苗作用[19], 是活載體疫苗的理想宿主。另有研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)酵母細(xì)胞表面大概能夠展示表達(dá)104個(gè)凝集素蛋白, 易于高效表達(dá)具有生物活性的復(fù)雜蛋白, 且不存在內(nèi)毒素的問(wèn)題[9,20]。因此, 本研究采用a凝集素展示系統(tǒng)對(duì)SVCV G蛋白進(jìn)行釀酒酵母表面展示, 旨在為SVCV的口服活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

圖 5 G蛋白酵母表面展示的免疫熒光檢測(cè)Fig. 5 Immun of luorescence of G protein displayed on yeast surface

圖 6 G蛋白酵母細(xì)胞表面展示的流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fig. 6 Flow cytometry analysis of G protein displayed on yeast surface

目前, 已有利用畢赤酵母細(xì)胞分泌型表達(dá)SVCV G蛋白的報(bào)道[21,22], 但是并沒(méi)有利用釀酒酵母細(xì)胞錨定型表達(dá)SVCV G蛋白的報(bào)道。釀酒酵母細(xì)胞展示系統(tǒng)改進(jìn)畢赤酵母細(xì)胞以甲醇作為碳源提供能量的缺陷, 利用半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo), 使所制備的疫苗產(chǎn)品安全性更高。同時(shí)釀酒酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)中的G蛋白直接裸露在細(xì)胞表面, 增多了抗原被識(shí)別的機(jī)會(huì), 更宜直接口服免疫動(dòng)物[6]。

鯉春病毒血癥病是一種引發(fā)鯉科魚(yú)類(lèi)高死亡率的病毒病, 而現(xiàn)今對(duì)于該病尚無(wú)商業(yè)化的特效疫苗,找到一種安全可行的防治措施是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。目前, 魚(yú)用疫苗接種方式主要包括： 注射法、基因槍法、浸泡法、口服法[23]。其中浸泡法和口服法是最歡迎的接種方式, 解決了工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的弊端。本研究綜合考慮疫苗安全性以及接種方式的操作性等方面, 首次將SVCV的G蛋白展示在釀酒酵母細(xì)胞表面。將誘導(dǎo)表達(dá)后的酵母細(xì)胞利用細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。結(jié)果證明在一定時(shí)間內(nèi), 酵母熒光強(qiáng)度隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加且誘導(dǎo)48h即可達(dá)到表達(dá)平臺(tái)期。因此, 可直接選用48h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間, 應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)中, 達(dá)到省時(shí)省力的目的。本研究成功實(shí)現(xiàn)了SVCV G蛋白的釀酒酵母細(xì)胞表面的展示, 為今后制備抗SVCV的口服活載體疫苗的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。