王 豐 張家華 沈玉幫 , 徐曉雁 , 王榮泉 李家樂(lè) ,

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 4. 蘇州市申航生態(tài)科技發(fā)展股份有限公司農(nóng)業(yè)部大宗淡水魚(yú)類繁育與健康養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215221)

青魚(yú)(Mylopharyngodon piceus)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類, 也是長(zhǎng)江流域重要的漁業(yè)資源。隨著人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境的破壞和水利設(shè)施的建設(shè), 以及過(guò)度捕撈等情況的存在, 長(zhǎng)江中的青魚(yú)資源遭到了嚴(yán)重的破壞[1], 青魚(yú)的數(shù)量也在急劇下降, 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所對(duì)四大家魚(yú)早期資源的監(jiān)測(cè)顯示, 青魚(yú)的產(chǎn)卵量從1997年的7.68億粒下降到了2009年的2.90萬(wàn)粒[1]。目前有關(guān)青魚(yú)遺傳多樣性的研究數(shù)量甚少,僅有少量基于蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)[2]、線粒體基因[3,4]、微衛(wèi)星標(biāo)記[5]遺傳變異的報(bào)道。對(duì)于青魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā), 除了利用青魚(yú)作為樣本[6], 也有使用其他物種的微衛(wèi)星在青魚(yú)上進(jìn)行跨物種擴(kuò)增的報(bào)道[7]。

微衛(wèi)星標(biāo)記由于其具有高度的多態(tài)性, 在整個(gè)基因組中隨機(jī)分布, 數(shù)量十分豐富, 且具有較高的保守性, 為共顯性遺傳, 符合孟德?tīng)栠z傳定律, 較其他分子標(biāo)記具有更多的信息量[8], 因此被廣泛應(yīng)用于各種遺傳學(xué)相關(guān)研究中[9]。微衛(wèi)星標(biāo)記作為研究工具對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性分析、分子育種和種質(zhì)鑒定等方面[10,11]起到了重要的推動(dòng)作用。

本研究使用自主開(kāi)發(fā)的12對(duì)青魚(yú)微衛(wèi)星引物對(duì)收集到的 4個(gè)野生群體和1個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 以期為青魚(yú)種質(zhì)資源的評(píng)估和保護(hù)提供資料和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于遺傳分析的青魚(yú)樣本來(lái)源于國(guó)內(nèi)國(guó)家級(jí)四大家魚(yú)原良種場(chǎng), 包括4個(gè)野生群體, 1個(gè)養(yǎng)殖群體。吳江養(yǎng)殖群體于2016年從江蘇吳江四大家魚(yú)良種場(chǎng)收集, 石首、邗江、嘉興、湘江野生群體于2017年分別從湖北石首老河長(zhǎng)江四大家魚(yú)原種場(chǎng)、江蘇邗江長(zhǎng)江系家魚(yú)原種場(chǎng)、浙江嘉興長(zhǎng)江四大家魚(yú)原種場(chǎng)、湖南省魚(yú)類原種場(chǎng)收集, 具體位置和信息見(jiàn)表 1。采集其鰭條組織, 用無(wú)水乙醇固定, 在4 ℃冰箱中保存。

表 1 五個(gè)青魚(yú)群體采集信息Tab. 1 Sampling information of five populations of black carp

1.2 基因組DNA提取

本研究使用海洋生物基因組DNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)進(jìn)行DNA的提取, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA是否降解, 用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo, 德國(guó))檢測(cè)DNA純度和濃度, 然后將提取的DNA轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中, 用硅膠蓋封存, 置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增及分型

本研究所用的微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)自于自主開(kāi)發(fā)的標(biāo)記, 引物由上海邁浦生物科技有限公司合成, 上游引物在5′端修飾FAM或HEX熒光基團(tuán)(表 2)。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL (2×TaqMix 12.5 μL、10 μmol/L primer 1 μL、20 ng/μL DNA 1.5 μL和ddH2O 10 μL), 并調(diào)整合適的退火溫度以得到清晰和特異性高的條帶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性2min, 然后94℃變性30s、退火溫度30s、72℃延伸1min, 重復(fù)30次循環(huán), 最后72℃延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf梯度PCR儀上進(jìn)行。

每個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)上機(jī), 采用的內(nèi)標(biāo)為ROX500, 由上海邁浦生物科技有限公司使用ABI3730XL全自動(dòng) DNA 測(cè)序儀進(jìn)行微衛(wèi)星分型, 獲得每個(gè)個(gè)體在不同位點(diǎn)上的等位基因數(shù)據(jù), 用Genemapper Version 4.0[12,13]軟件進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的讀取。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小確定個(gè)體在該位點(diǎn)的基因型, 使用POPGEN32[14]計(jì)算得到各位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、近交系數(shù)(Fis)、種群間遺傳分化系數(shù)(FST)、種群間遺傳距離和各位點(diǎn)基因頻率等信息;用Cervus 3.0[15]計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC),及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)?；谌后w間的Nei’s遺傳距離使用MEGA 5.0構(gòu)建UPGMA 系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

本實(shí)驗(yàn)共使用了12個(gè)位點(diǎn), 這12對(duì)微衛(wèi)星引物在5個(gè)青魚(yú)群體中各個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分析擴(kuò)增結(jié)果得到了12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性信息(表 3)。分析結(jié)果顯示這12個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)青魚(yú)群體中的等位基因數(shù)(Na)介于7—29, 有效等位基因數(shù)(Ne)介于3.347—13.730, 平均等位基因數(shù)和平均有效等位基因數(shù)分別為18.429和7.805, 其中MP20和MP65等位基因數(shù)最少都為7, MP54位點(diǎn)所具有的等位基因數(shù)最多為29。各位點(diǎn)的Shannon多樣性指數(shù)介于1.442—2.833, 觀測(cè)雜合度(Ho)介于0.623—0.937, 期望雜合度(He)介于0.703—0.929, 多態(tài)信息含量(PIC)介于0.660—0.923, 表明這12個(gè)位點(diǎn)均具有高度多態(tài)性(PIC＞0.5), 種群間遺傳分化系數(shù)(FST)介于0.034—0.173, Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示有3個(gè)位點(diǎn)(MP40、MP49和MP62)極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。

表 2 青魚(yú)12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星引物信息Tab. 2 12 pairs of Primers from black carp

2.2 青魚(yú)群體的遺傳多樣性

5個(gè)群體的遺傳多樣性信息如表 4所示, 結(jié)果顯示5個(gè)群體的平均等位基因數(shù)(Na)介于7.917—11.667,其中嘉興群體平均等位基因最少, 邗江群體最多;平均有效等位基因數(shù)(Ne)介于4.837—6.035, 其中石首群體最少, 邗江群體最多; 平均觀測(cè)雜合度介于0.713—0.861, 其中吳江群體最低, 嘉興群體最高;平均期望雜合度介于0.749—0.819, 其中湘江群體最低, 邗江群體最高; 平均多態(tài)信息含量介于0.711—0.788, 其中湘江群體最低, 邗江群體最高, 且多態(tài)信息含量的P值均大于0.5, 表明這5個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性。

5個(gè)群體Shannon多樣性指數(shù)(I)介于1.715—1.949, 其中石首群體最低, 邗江群體最高。除邗江群體相對(duì)稍高外, 其他各群體之間相差不大, 且5個(gè)群體的shannon多樣性指數(shù)從高到低排列依次為邗江＞吳江＞嘉興＞湘江＞石首, 與各群體平均有效等位基因數(shù)的大小順序相吻合, 說(shuō)明在這5個(gè)青魚(yú)群體中, 邗江群體具有較高的等位基因豐富度, 而石首群體的等位基因豐富度相對(duì)較低。

表 3 青魚(yú)12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity information of 12 microsatellites in black carp

表 4 青魚(yú)5個(gè)群體的遺傳多樣性Tab. 4 Genetic diversity of 5 populations in black carp

2.3 群體間遺傳分化及遺傳距離分析

根據(jù)12對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)5個(gè)青魚(yú)群體間的遺傳距離和遺傳相似度進(jìn)行了分析計(jì)算(表 5)。5個(gè)群體各群體間的遺傳距離介于0.207—0.875, 其中邗江群體和嘉興群體遺傳距離最小(0.207), 湘江群體和吳江群體遺傳距離最大(0.875)。各群體間的遺傳相似度介于0.417—0.813, 其中湘江群體和吳江群體遺傳相似度最小(0.417), 邗江群體和嘉興群體遺傳相似度最大(0.813)。

基于群體間Nei’s遺傳距離(DA)構(gòu)建UPGMA聚類樹(shù)如圖 1所示, 結(jié)果顯示邗江群體和嘉興群體首先聚為一支, 然后與石首和湘江兩個(gè)群體聚為一支,最后與吳江群體聚為一支。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體中的遺傳多樣性水平

多態(tài)信息含量(PIC)是評(píng)價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重要參考標(biāo)準(zhǔn), 若PIC＞0.5表明該位點(diǎn)具有高度多態(tài)性,若0.25＜PIC＜0.5表明該位點(diǎn)具有中度多態(tài)性, 若PIC＜0.25表明該位點(diǎn)具有低度多態(tài)性。本研究所用的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因分布相對(duì)均勻, 所含等位基因數(shù)介于7—29, 平均多態(tài)信息含量在5個(gè)青魚(yú)群體中均在0.7以上, 觀測(cè)雜合度及期望雜合度均具有較高水平(Ho＞0.7,He＞0.7)。本實(shí)驗(yàn)中位點(diǎn)MP20在石首群體中(PIC=0.499)以及位點(diǎn)MP36和MP65在湘江群體中(PIC=0.444)表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5), 但都接近0.5, 可能與所用群體該位點(diǎn)的多態(tài)性相對(duì)較低有關(guān), 另外采樣的隨機(jī)性以及群體數(shù)量的大小也可能對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響, 從而導(dǎo)致在單一群體中位點(diǎn)多態(tài)性低于應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出的高多態(tài)性水平。

表 5 青魚(yú)5個(gè)群體的遺傳距離和遺傳相似度Tab. 5 Genetic distance and genetic similarity of 5 populations in black carp

圖 1 基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的5個(gè)青魚(yú)群體UPGMA聚類樹(shù)Fig. 1 UPGMA trees among 5 populations of black carp constructed based on Nei’s genetic distance

Guo等[7]利用草魚(yú)的微衛(wèi)星標(biāo)記在青魚(yú)群體中跨物種擴(kuò)增各位點(diǎn)擴(kuò)增所得的等位基因數(shù)在0—12不等, 分布十分不均勻, 而且許多位點(diǎn)擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為0或1, 大多小于5; 本研究中所用微衛(wèi)星標(biāo)記各位點(diǎn)在群體中擴(kuò)增所得的等位基因數(shù)明顯比之要多, 且均在5以上, 與之相比, 本研究和Zhu等[6]所用的微衛(wèi)星標(biāo)記在青魚(yú)群體中擴(kuò)增結(jié)果較為理想。

使用其他物種的微衛(wèi)星標(biāo)記跨物種擴(kuò)增可能出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增結(jié)果[16]、所得等位基因數(shù)低于預(yù)期、擴(kuò)增非同源產(chǎn)物[17]等問(wèn)題, 這些問(wèn)題可能會(huì)增加分析過(guò)程的復(fù)雜程度和降低研究結(jié)果的準(zhǔn)確性, 在使用中需要進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和驗(yàn)證, 而使用本物種所屬的微衛(wèi)星標(biāo)記則可以有效避免類似問(wèn)題的出現(xiàn), 因此開(kāi)發(fā)本物種的微衛(wèi)星標(biāo)記十分必要。

總體來(lái)說(shuō), 本研究所用的12個(gè)位點(diǎn)均具有較豐富的遺傳多樣性, 遺傳多樣性比較豐富, 可用于青魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳育種、遺傳多樣性分析等研究。

3.2 群體的遺傳多樣性水平

生物群體的遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種種質(zhì)資源狀況的重要依據(jù)之一。維持種內(nèi)的遺傳多樣性水平, 是種質(zhì)保護(hù)的最終目的, 也是種質(zhì)資源能持續(xù)利用的基礎(chǔ)。群體的有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度以及多態(tài)信息含量都是衡量群體遺傳多樣性的參考標(biāo)準(zhǔn), 群體的基因豐富度越高,將在這些方面表現(xiàn)出越高的數(shù)值[18]。在本研究中,5個(gè)青魚(yú)群體的平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度以及平均多態(tài)信息含量的值均在0.7以上, 說(shuō)明各群體的遺傳多樣性水平均處于較高水平。

方耀林等[19]用RAPD法對(duì)長(zhǎng)江水系青魚(yú)遺傳多樣性進(jìn)行分析, 湘江群體的平均觀測(cè)雜合度為0.832, 其實(shí)驗(yàn)所用青魚(yú)湘江群體與本研究樣本同樣采集于長(zhǎng)沙四大家魚(yú)原種場(chǎng)。在本研究中湘江群體的平均觀測(cè)雜合度為0.792, 與之相比稍低, 表明2004—2017年期間青魚(yú)湘江群體的遺傳多樣性可能有一定程度的降低; 在本研究中湖北石首群體平均觀測(cè)雜合度明顯低于其研究中湖北金口群體, 可能同樣存在遺傳多樣性降低的情況。但由于實(shí)驗(yàn)所用群體數(shù)量較少, 采樣時(shí)間跨度較長(zhǎng), 尚難以形成確定的結(jié)論, 還需進(jìn)行更多相關(guān)研究以進(jìn)行確認(rèn)。Hunter和Nico[5]報(bào)道了引入于美國(guó)密西西比河流域青魚(yú)的遺傳多樣性, 結(jié)果顯示期望雜合度平均為0.224, 遠(yuǎn)低于本研究, 可能是當(dāng)時(shí)引入的群體小和分析的樣本少的緣故。

等位基因在群體中分布的越均勻,Ne和Na就越接近[20], 在本研究中每個(gè)群體的Ne均小于Na, 群體的平均Ne小于Na, 主要是等位基因在群體中分布不均勻, 導(dǎo)致某些等位基因的頻率不夠平均。這說(shuō)明各群體均存在等位基因分布不均勻的情況, 且不均勻程度吳江＞石首＞邗江＞湘江＞嘉興。

3.3 群體的遺傳結(jié)構(gòu)

基于群體間Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹(shù)顯示嘉興群體和邗江群體首先聚為一支, 之后和石首群體和湘江群體聚為一支, 最后與吳江群體聚為一支。從地理分布上來(lái)說(shuō), 邗江和嘉興2個(gè)群體位于長(zhǎng)江下游, 石首和湘江2個(gè)群體位于長(zhǎng)江中游,這4個(gè)群體的遺傳距離和地理距離具有較強(qiáng)的相關(guān)性, 在聚類樹(shù)上表現(xiàn)出較為明顯的東西分布。但是同處長(zhǎng)江下游的吳江群體與邗江和嘉興兩群體的遺傳距離反而較遠(yuǎn), 并且地理距離最近的吳江群體和嘉興群體的遺傳距離反而較遠(yuǎn), 結(jié)合采樣地點(diǎn)水域環(huán)境類型, 推斷可能與吳江群體所在水域存在太湖這一大面積湖泊環(huán)境, 而其他4個(gè)群體所在水域無(wú)類似水文環(huán)境, 從而導(dǎo)致吳江群體與其他4個(gè)群體產(chǎn)生了較大的遺傳分化。關(guān)于青魚(yú)多個(gè)群體的遺傳變異的研究目前僅見(jiàn)方耀林等[17]的研究, 但其所做研究?jī)H涉及長(zhǎng)江中游3個(gè)群體, 因此無(wú)法為該情況提供更多參考。在傅建軍等[21]的研究中, 在吳江、石首、邗江3個(gè)地區(qū)的草魚(yú)群體中, 吳江和邗江聚為一支, 石首與之聚為一支, 與本研究中情況并不相同。因此對(duì)于該情況, 尚需更多進(jìn)一步的研究。