秦泗佳,劉昌奎,蘇軍龍,張軍峰2,

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理學(xué)教研室,西安 710021;2陜西省腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室;4西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部人體解剖學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:2004075332@163.com)

三叉神經(jīng)痛是指三叉神經(jīng)所支配的區(qū)域發(fā)生的強(qiáng)烈的陣發(fā)性疼痛。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不完全清楚,相繼提出了許多學(xué)說(shuō),但比較公認(rèn)且有顯微解剖學(xué)證據(jù)的是局部微血管壓迫學(xué)說(shuō)。三叉神經(jīng)的血液供應(yīng)主要來(lái)自基底動(dòng)脈的腦橋支及小腦下前動(dòng)脈,已有學(xué)者詳細(xì)報(bào)道了它們?cè)谏窠?jīng)外的起源和分布[1-5],但對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管的具體分布特點(diǎn)仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要研究SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管的分支、分布及走行特點(diǎn),為三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制的研究提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠2只,體質(zhì)量200-220 g,購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雄性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和軟件

明膠(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);一得閣墨汁(北京);伊紅-蘇木素染液;體視鏡(OLYMPUS SZ2-ST);光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX43);焦點(diǎn)堆迭軟件(Zerene Stacker 1.02)。

1.3 灌注、取材及切片

腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露心臟，左心室插管，右心耳放血，快速灌注0.9%氯化溶液，至流出液清亮，4%多聚甲醛灌注，隨后用過(guò)濾的37 ℃ 5%明膠-墨汁混合液灌注，至大鼠眼結(jié)膜和口唇及全身皮膚變黑為止，結(jié)扎肺動(dòng)脈、肺靜脈、主動(dòng)脈弓和上、下腔靜脈，-4 ℃冷凍15 min。開(kāi)顱后在三叉神經(jīng)根與腦連接處剪斷，仔細(xì)分離并去除三叉神經(jīng)節(jié)周圍的骨組織，剪斷并獲取三叉神經(jīng)節(jié)(左右各2個(gè))，放入4%多聚甲醛固定液內(nèi)固定24 h，蒸餾水洗10 min，體視鏡下去除三叉神經(jīng)節(jié)外膜，經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后制作明膠-墨汁灌注透明標(biāo)本，體視鏡下觀察，并進(jìn)行不同焦距層面的拍照。將明膠-墨汁灌注的透明標(biāo)本經(jīng)無(wú)水乙醇去除二甲苯后行石蠟包埋，切片(厚10 μm)，60 ℃烤片3 h，經(jīng)脫蠟、水化，HE染色，再經(jīng)二甲苯透明和中性樹(shù)膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.4 圖像及切片處理

將體視鏡下所得的不同焦距層面的圖像導(dǎo)入到Zerene Stacker軟件中進(jìn)行焦點(diǎn)堆迭。HE染色的切片,光學(xué)顯微鏡下取不同部位放大400倍拍照。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)的焦點(diǎn)堆迭

在體視鏡下,將SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)放大3.2倍,每側(cè)共獲取不同焦距層面的圖像22張,然后進(jìn)行焦點(diǎn)堆迭后獲得1張圖像(見(jiàn)圖1)。SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)不同焦距層面的圖像能夠清晰顯示該焦距層面部分血管的分支、分布及走向,另一部分則被其他層面的組織遮擋顯得模糊(圖1A-E)。焦點(diǎn)堆迭的圖像可以清晰顯示整個(gè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管的分支、分布及走向(圖1F)。下頜神經(jīng)神經(jīng)元胞體聚集區(qū)微血管的數(shù)量多,血管密度大,顏色很深,血管在不同層面發(fā)出分支不斷交互吻合形成立體的微血管網(wǎng),然后順神經(jīng)纖維方向分支順行,密度隨之降低,顏色變淺。上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干神經(jīng)元胞體聚集區(qū)較大,微血管的數(shù)量亦眾多,血管密度大,顏色深,血管在不同層面發(fā)出分支不斷交互吻合形成立體的微血管網(wǎng),然后沿神經(jīng)纖維方向分支順行,密度隨之降低,顏色變淺。在兩大神經(jīng)元胞體聚集區(qū)之間近下頜神經(jīng)分叉處的微血管的數(shù)量和密度比上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干神經(jīng)元胞體聚集區(qū)近心端內(nèi)側(cè)面的微血管數(shù)量和密度要大,血管分支多,顏色深。

A-E.不同層面的圖像;F.焦點(diǎn)堆迭后的圖像;1.下頜神經(jīng);2.上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干圖1 SD大鼠左側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)不同焦點(diǎn)層面及焦點(diǎn)堆迭后圖像 (×3.2)Figure 1 Image of left trigeminal ganglion of SD rats at different focal levels and after focus stacking (×3.2)

2.2 SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)切片的HE染色

將SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)切片后行HE染色,鏡下放大400倍后獲取不同部位的圖像。在神經(jīng)元胞體聚集區(qū),神經(jīng)元胞體與胞體之間分布著大量的微血管,管徑較小,密度較大,分支分叉交互成網(wǎng)包繞在神經(jīng)元胞體周圍(見(jiàn)圖2A)。在神經(jīng)元胞體聚集區(qū)與神經(jīng)纖維聚集區(qū)交界處仍可見(jiàn)靠近神經(jīng)元胞體聚集區(qū)的微血管數(shù)量比靠近神經(jīng)纖維聚集區(qū)的微血管數(shù)量要多,微血管的斷面逐漸變長(zhǎng),說(shuō)明微血管的走行方向由神經(jīng)元胞體聚集區(qū)的網(wǎng)狀逐漸向沿神經(jīng)纖維縱向走行的方向過(guò)渡,微血管的密度降低,但血管的直徑有所增加(見(jiàn)圖2B)。在神經(jīng)纖維聚集區(qū),微血管的密度進(jìn)一步降低,血管的長(zhǎng)度進(jìn)一步增長(zhǎng),方向也呈現(xiàn)順沿神經(jīng)纖維長(zhǎng)軸方向延伸,在走行過(guò)程中可斜向或縱向發(fā)出分支分叉吻合成網(wǎng),但密度較神經(jīng)元胞體聚集區(qū)小(見(jiàn)圖2C)。

A.神經(jīng)元胞體聚集區(qū) B.神經(jīng)元胞體與神經(jīng)纖維交界區(qū) C.神經(jīng)纖維聚集區(qū)圖2 SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)切片HE染色 (×400)Figure 2 HE staining of trigeminal ganglion sections in SD rats (×400)

3 討論

近年來(lái)的研究表明,三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)或假設(shè)及其相應(yīng)的治療方法,目前關(guān)于神經(jīng)受壓迫使神經(jīng)微循環(huán)障礙致神經(jīng)脫髓鞘變而產(chǎn)生神經(jīng)痛的周圍學(xué)說(shuō)占主流[6-8]。研究大鼠三叉神經(jīng)的微血管的分支、分布及走行規(guī)律可為探究人三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制提供方法。但是,大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)與人的三叉神經(jīng)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)存在較多差別,大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)發(fā)出下頜神經(jīng)和上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干,即上頜神經(jīng)和眼神經(jīng)合為一個(gè)神經(jīng)干。神經(jīng)干近段走行于大腦的腹側(cè),兩支近乎平行向前稍內(nèi)側(cè)走行,頸內(nèi)動(dòng)脈及其分支伴行并營(yíng)養(yǎng)之;下頜神經(jīng)的主干較短,起于三叉神經(jīng)節(jié)的外側(cè),行向前外,出顱后即分為數(shù)支。

焦點(diǎn)堆迭是用多張不同焦點(diǎn)的照片,它們的對(duì)焦點(diǎn)在同一背景上拼接呈一幅照片[9]。本研究每側(cè)三叉神經(jīng)共獲取不同焦點(diǎn)層面的照片22張,進(jìn)行焦點(diǎn)堆迭后合成1張照片(圖1F),該照片可清晰顯示整個(gè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管的分支、分布及走向。下頜神經(jīng)和上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干神經(jīng)元胞體聚集的區(qū)微血管的數(shù)量多,血管密度大,顏色深,血管在不同層面發(fā)出分支不斷交互吻合形成立體的微血管網(wǎng)。在神經(jīng)節(jié)前外側(cè)部近下頜神經(jīng)分叉處的遠(yuǎn)心端微血管的數(shù)量和密度比上頜神經(jīng)-眼神經(jīng)干神經(jīng)元胞體聚集區(qū)近心端內(nèi)側(cè)面的微血管的數(shù)量和密度要大,血管分支多,顏色深。有研究已利用此技術(shù)進(jìn)行了大鼠三叉神經(jīng)痛模型三叉神經(jīng)和眶下神經(jīng)微循環(huán)變化的研究,結(jié)果均能很好地顯示三叉神經(jīng)痛模型神經(jīng)內(nèi)微循環(huán)隨著時(shí)間推移的變化[10,11]。

本研究用過(guò)濾的40 ℃ 5%明膠-墨汁混合液灌注SD大鼠，游離三叉神經(jīng)并去除神經(jīng)外膜，經(jīng)石蠟包埋切片后行HE染色。明膠-墨汁灌注能很好地顯示血管，尤其是微血管，而HE染色又能很好地顯示神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維，將兩者結(jié)合起來(lái)就能顯示神經(jīng)與血管的關(guān)系，顯示神經(jīng)內(nèi)微血管的分支、分布及走行規(guī)律[12]。在神經(jīng)元胞體聚集區(qū)分布著大量的微血管,管徑較小,密度較大,分支分叉交互成密網(wǎng)包繞在神經(jīng)元胞體周圍。在神經(jīng)纖維聚集區(qū)微血管的密度較小,血管的長(zhǎng)度增長(zhǎng),沿神經(jīng)纖維長(zhǎng)軸方向延伸,可斜向或縱向發(fā)出分支分叉吻合成疏網(wǎng)。在神經(jīng)元胞體與神經(jīng)纖維的交界區(qū)近神經(jīng)元胞體聚集區(qū)的微血管數(shù)量比近神經(jīng)纖維聚集區(qū)的微血管數(shù)量要多,微血管的走行方向由神經(jīng)元胞體聚集區(qū)的網(wǎng)狀逐漸向沿神經(jīng)纖維縱向走行過(guò)渡,微血管的密度降低,斷面逐漸變長(zhǎng),直徑增大。此結(jié)果說(shuō)明,在需氧量和能量較多的區(qū)域微血管的數(shù)量多、密度大、呈密網(wǎng)狀,在相對(duì)需氧量和能量少的區(qū)域微血管數(shù)量少、密度小、沿長(zhǎng)軸呈疏網(wǎng)狀,符合神經(jīng)生理解剖及功能需要的特點(diǎn)。