夏悅 賴維 劉玉芳 張杰 鄭躍

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣州 510630

皮膚慢性紫外線損傷（光老化）不僅影響容貌，還可造成皮膚完整性及免疫系統(tǒng)的損害，甚至可引發(fā)光線性肉芽腫等多種光相關(guān)疾病，嚴重者可導(dǎo)致基底細胞癌、鱗狀細胞癌和惡性黑素瘤等皮膚腫瘤［1-2］。皮膚光老化的機制至今未明，紫外線對皮膚細胞的基因損傷在其發(fā)生機制中起重要作用。已有研究表明，DNA 損傷以及DNA 修復(fù)異常參與皮膚慢性光損傷的發(fā)生［3-5］，反復(fù)紫外線照射可以引起多種類型DNA 損傷，包括形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體、胸腺嘧啶二聚體等［6-7］，是光源性皮膚腫瘤發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。但長期反復(fù)長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞DNA損傷修復(fù)及復(fù)制過程的影響目前仍不清楚，因此，我們對此進行研究。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞：來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科3例兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，年齡5 ～7歲。本研究通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（批準號［2016］2-44），患兒家屬均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素（美國Gibco公司），細胞衰老半乳糖苷酶（SA-β-Gal）試劑盒（美國Cell signaling technology 公司），細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。UVA照射儀（Sigma SS-03A，燈管為Philips UVATLl0RS，波長320 ～400 nm）和UVA照射計均產(chǎn)自上海希格瑪高科技有限公司。RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）、NanoPhotometer?分光光度計（美國IMPLEN 公司）、RNA 檢測試劑盒（美國Agilent Technologies 公 司）、熒光定量儀 Qubit?3.0 Flurometer（美國Life Technologies 公司），二代測序RNA 文庫制備試劑盒（英國NEB 公司）、PCR 試劑盒（英國QIAGEN 公司）、核酸純化試劑盒（北京艾德科技有限公司）。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：取兒童包皮，參照文獻［8］分離培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，培養(yǎng)至第3 代凍存，取細胞復(fù)蘇后10 代以內(nèi)的細胞行后續(xù)實驗。

2.建立皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型：將3 ～6代成纖維細胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到70%融合時，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后，加2 ml PBS將細胞分為UVA組和對照組。。參照文獻［8-10］，將UVA 組細胞置于UVA 輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率12.7 mW/cm2，單次照射時間為780 s，照射劑量為 9.9 J/cm2，照射結(jié)束后 PBS 洗滌 1 次，加入 2 ml DMEM培養(yǎng)基，每24 h照射1次，連續(xù)照射14 d。對照組細胞加入PBS后置于超凈臺避光，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。

3.MTT法檢測皮膚成纖維細胞增殖活性：將末次UVA照射后成纖維細胞按每孔5×103個接種于96孔培養(yǎng)板中，每組各設(shè)3個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl CCK8 試劑，37 ℃孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450 nm 處吸光度（A值）。細胞活性（%）=（AUVA照射組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%，實驗重復(fù)3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色檢測細胞老化比率：末次UVA 照射后 48 h 去除DMEM培養(yǎng)基，PBS 洗 滌1次，按照試劑盒說明書檢測兩組細胞老化。顯微鏡下老化細胞胞質(zhì)被染成藍色，每皿至少計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復(fù)3次，取均值。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞為1×106/ml。每組取1 ml細胞，預(yù)冷PBS洗滌3次后細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液。加入10 μl異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V，避光反應(yīng)20 min，沖洗固定后，加入0.5 ml 碘化丙錠染色，4 ℃反應(yīng)30 min。加入300 μl 結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

6.表達基因譜分析：將UVA 組和對照組細胞分別使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將全部基因完整轉(zhuǎn)錄為總RNA，使用NanoPhotometer?分光光度計檢測樣品的純度和粗濃度，隨后用熒光定量儀Qubit?3.0 Flurometer檢測RNA樣品準確濃度，RNA檢測試劑盒檢測RNA 樣品完整性。檢測合格后，對照組及UVA組各取0.5 ～5 μg總RNA，根據(jù)二代測序RNA 文庫制備試劑盒的操作步驟，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，隨后將mRNA打斷成短片段，以mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成單鏈cDNA，然后合成雙鏈cDNA，隨后利用PCR 試劑盒純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進行末端修復(fù)、加尾并連接測序接頭，用核酸純化試劑盒回收目的基因片段后進行PCR 富集，獲得cDNA文庫。

cDNA 測序：先通過 qPCR，對 cDNA 的有效濃度進行準確定量（濃度＞10 nmol），隨后使用HiSeq SR Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumia）試劑在cBot上生成簇，之后用HiSeq 2500 測序平臺對收集的cDNA樣本進行測序。

KEGG差異表達富集分析：將對照組與UVA組的cDNA測序結(jié)果進行比較，對差異表達的基因通過基因組破譯數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/）進行京都基因與基因組百科全書分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），對染色體的全部基因表達蛋白在細胞活動過程中的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)作出預(yù)測。然后對KEGG 中每個信號通路應(yīng)用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因中顯著富集的信號通路。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件。兩獨立樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型的建立

UVA 組細胞體積變大，細胞內(nèi)顆粒增多，出現(xiàn)慢性光損傷表型（圖1），細胞活性明顯低于對照組，細胞老化率和凋亡率均高于對照組（P＜0.05）。見表1。

二、關(guān)鍵酶差異表達基因檢測

在 DNA 錯配修復(fù)、DNA 復(fù)制和 DNA 堿基切除修復(fù)過程的關(guān)鍵酶中，UVA 組和對照組細胞之間出現(xiàn)表達差異的為DNA連接酶（Lig）1、核糖核酸酶H（RNaseH）2A 以及解旋酶Dna2，UVA 組上述基因表達水平均低于對照組（P＜0.01）。見表2。

圖1 顯微鏡下觀察反復(fù)長波紫外線（UVA）照射誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞慢性光損傷（×100） UVA 組細胞與對照組相比體積變大，細胞內(nèi)顆粒增多，出現(xiàn)慢性光損傷表型

表1 長波紫外線（UVA）反復(fù)照射對成纖維細胞活性、老化率、凋亡率的影響（，%）

表1 長波紫外線（UVA）反復(fù)照射對成纖維細胞活性、老化率、凋亡率的影響（，%）

注：n=3

UVA照射組對照組t值P值細胞凋亡率29.0±3.3 6.0±5.9 5.89＜0.05細胞活性72.0±5.2 96.0±3.7 6.51＜0.05細胞老化率79.7±5.2 6.4±0.8 24.12＜0.05

表2 長波紫外線（UVA）照射誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞慢性光損傷過程中差異表達的DNA復(fù)制及修復(fù)關(guān)鍵酶基因

三、關(guān)鍵酶差異表達對皮膚成纖維細胞DNA修復(fù)的影響

KEGG分析顯示，UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞慢性光損傷后，在DNA 堿基修復(fù)過程，Lig 表達下調(diào)，導(dǎo)致 DNA 單堿基修復(fù)受阻，Lig 及 Lig1 表達下調(diào)導(dǎo)致DNA 多堿基修復(fù)過程受阻；在DNA 錯配修復(fù)過程，由于Lig1 基因表達下調(diào)，即使DNA 內(nèi)切酶、復(fù)制因子C（RFC）、錯配修復(fù)酶（PMS2）、DNA錯配切割酶（Mut）家族及其同源蛋白家族（MLH1、MLH2、MLH3、MLH6、PMS2）、DNA 復(fù) 制 蛋 白（RPA）、DNA 聚合酶（ExoI）表達無明顯變化，修復(fù)過程亦受阻；在DNA 復(fù)制過程，RNaseH2A、Dna2、Lig1表達下調(diào)，復(fù)制過程受阻。

討 論

引起皮膚光老化的機制復(fù)雜多樣，主要涉及DNA 損傷、氧化應(yīng)激、基質(zhì)金屬蛋白酶、炎癥反應(yīng)等方面。紫外線作用于皮膚表皮角質(zhì)形成細胞，可引起細胞DNA 損傷，進而引發(fā)皮膚炎癥、免疫抑制，嚴重時可導(dǎo)致皮膚腫瘤［11］。我們在2017年使用高通量測序方法，發(fā)現(xiàn)慢性紫外線照射人皮膚成纖維細胞，可引起607條基因表達改變，其中238條基因表達上調(diào)，369 條基因表達下調(diào)，這些表達改變的基因參與細胞的多種生物過程，包括細胞代謝、細胞內(nèi)成分合成、細胞功能及信號通路［12］。本研究是在前期發(fā)現(xiàn)差異表達基因的基礎(chǔ)上，研究慢性紫外線照射對人皮膚成纖維細胞DNA復(fù)制及修復(fù)過程的影響。

在哺乳動物細胞中，目前研究較多的DNA 修復(fù)通路包括核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、重組修復(fù)和錯配修復(fù)。機體的DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)可對損傷的DNA 進行修復(fù)來維持DNA 的完整性，修復(fù)失敗或錯誤修復(fù)則可導(dǎo)致細胞凋亡以及可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已有研究表明，DNA 損傷修復(fù)異常與多種皮膚病發(fā)生密切相關(guān)［13］。Yu 和 Lee［14］針對紫外線照射導(dǎo)致細胞活性氧的產(chǎn)生增加直接致DNA 損傷機制進行研究，并闡述了許多紫外線引起的癥狀與核苷酸切除修復(fù)密切相關(guān)。本研究顯示，UVA 誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞慢性光損傷后，DNA 單堿基切除修復(fù)關(guān)鍵酶、DNA 錯配修復(fù)關(guān)鍵酶以及DNA復(fù)制關(guān)鍵酶表達均出現(xiàn)改變。

Lig 參與多種DNA 修復(fù)，可獨立完全修復(fù)部分DNA 單鏈斷裂。我們研究發(fā)現(xiàn)，在UVA 反復(fù)刺激后，皮膚成纖維細胞的堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、DNA 復(fù)制過程中均出現(xiàn)Lig1 的表達下調(diào)，提示UVA 通過抑制Lig1 表達，影響細胞DNA 的修復(fù)過程及復(fù)制過程。

DNA解旋酶作用于DNA兩條單鏈中間連接的堿基的氫鍵上，進而使兩條單鏈在該處分開。RNaseH 是一種核糖核酸內(nèi)切酶，能夠特異性地水解雜交到DNA 鏈上的RNA 磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA 雜交體系中的RNA 鏈。本研究顯示，UVA 反復(fù)刺激皮膚成纖維細胞，主要通過抑制Lig1、RNaseH2A、Dna2 基因表達，影響細胞DNA 的正常復(fù)制過程，進而通過下游的生物學(xué)效應(yīng)，引起細胞損傷及相關(guān)疾病發(fā)生。

近來一些新的研究表明，通過干預(yù)DNA 的損傷修復(fù)，可以預(yù)防紫外線誘發(fā)的皮膚光老化及相關(guān)皮膚?。òㄆつw腫瘤）［15］。Joo 等［16］證明，栝樓提取物通過調(diào)節(jié)BMAL1（brain and muscle aryl hydrocarbonreceptornucleartranslocatorlikeprotein 1）和miR-142-3p的表達來增強UVB誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，提出TKE 可作為治療與UVB 誘導(dǎo)的損傷相關(guān)皮膚病的潛在候選者。Shah和He［17］研究紫外線誘發(fā)的DNA 修復(fù)的分子機制，提出可通過調(diào)節(jié)核苷酸切除修復(fù)過程來預(yù)防癌癥發(fā)生和發(fā)展。Panich 等［18］進一步證明紫外線在誘導(dǎo)皮膚干細胞衰老過程中的損傷和氧化應(yīng)激作用，并提出一種新的抑制皮膚細胞慢性光損傷發(fā)生的方法。

綜上，本研究表明，重復(fù)UVA照射可直接作用于皮膚成纖維細胞DNA 堿基切除修復(fù)、DNA 錯配修復(fù)及DNA 復(fù)制過程中關(guān)鍵酶的基因表達，從而影響皮膚成纖維細胞DNA 修復(fù)及DNA 復(fù)制過程，參與皮膚慢性光損傷的發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)不僅進一步闡明了皮膚老化和光損傷的發(fā)生和修復(fù)機制，還可能為日后進一步研究皮膚光損傷及相關(guān)皮膚病的防治措施提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突