田靚 劉越 毛葉紅 連昕 李寧 呂曉華 陶娟 曾紹群 冉藝 曾敬思

1華中科技大學(xué)-武漢光電國家研究中心 Britton Chance 生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心，武漢 430074；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科，武漢 430022

田靚現(xiàn)在武漢大學(xué)中南醫(yī)院設(shè)備處 430071

劉越現(xiàn)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科 430022

淺部真菌病是一大類常見的真菌感染性疾病，其菌學(xué)診斷目前仍依賴于致病真菌的鏡檢和培養(yǎng)鑒定。盡管熒光染色液的應(yīng)用提高了鏡檢的準(zhǔn)確性和效率［1-3］，特別是一步法熒光染色液的應(yīng)用使檢驗(yàn)變得更加便捷［4-5］。但仍需專業(yè)技術(shù)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，如果面臨大量樣本待檢，檢驗(yàn)人員將承受巨大的勞動(dòng)強(qiáng)度。目前顯微成像系統(tǒng)（圖像自動(dòng)掃描）不僅限于生物基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，如腦神經(jīng)成像［6］，而且已開始應(yīng)用于臨床組織病理切片圖像的采集［7］，這為采用人工智能對(duì)影像數(shù)據(jù)做出結(jié)果判別提供了可能。國外已有學(xué)者［8］研發(fā)出圖像處理系統(tǒng)，用于自動(dòng)識(shí)別淺表真菌病臨床標(biāo)本熒光顯微圖像中的真菌菌絲，取得滿意效果，但尚未用于臨床檢驗(yàn)。本研究采用自主研發(fā)的熒光染色顯微成像及計(jì)算機(jī)輔助診斷系統(tǒng)（automated fluorescence microscopic imaging and computer aided diagnosis system，AFMICADS）檢測(cè)臨床疑似淺部真菌病送檢真菌標(biāo)本，以觀察該系統(tǒng)在臨床真菌學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的效果。

一、材料和方法

1.標(biāo)本及來源：據(jù)2016年華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科真菌室分離、鑒定的病原真菌統(tǒng)計(jì)分析，致病菌最多分離自體股癬患者，其次為甲真菌病和手足癬患者（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。故將來自上述疾患部位的皮屑、甲屑作為研究標(biāo)本。2018年7-9 月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院各臨床科室門診及住院疑似淺部真菌感染患者 106 例，男 50 例，女56 例，年齡6 ～ 72 歲。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（［2017］倫審字S008號(hào)），并免除知情同意。

2.主要試劑和儀器：一步法真菌熒光染色液Ⅱ型（南京漢瑞生物科技有限公司）；Leica DM500熒光顯微鏡（瑞士萊卡生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）；熒光染色顯微成像及計(jì)算機(jī)輔助診斷系統(tǒng)（AFMICADS）為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科與武漢光電國家研究中心合作研發(fā)（專利申請(qǐng)?zhí)朇N201810863813.1），計(jì)算機(jī)配置GeForce GTX1080顯卡，Excel 2007分析軟件。

3.方法：每例患者每個(gè)檢查部位取1個(gè)標(biāo)本，送檢標(biāo)本126 份，其中皮膚鱗屑83 份，甲屑43 份。將每一標(biāo)本分成3 份，分別用于常規(guī)鏡檢（10%氫氧化鉀溶液制片）、改良沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)（25 ℃）及熒光染色鏡檢。熒光染色鏡檢包括熒光染色人工鏡檢（下簡(jiǎn)稱“人工熒光鏡檢”）及AFMICADS熒光鏡檢。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲和/或孢子（包括芽孢）均認(rèn)為鏡檢結(jié)果為陽性。培養(yǎng)分離所得菌株進(jìn)行常規(guī)的形態(tài)學(xué)觀察（菌落及鏡下形態(tài)）、生理和生化實(shí)驗(yàn)方法鑒定菌種。其中酵母及酵母樣菌的菌種鑒定使用API20 C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)。

熒光染色鏡檢方法：將1 滴熒光染液（約50 μl）滴加到放置于載玻片上的標(biāo)本處，加蓋蓋玻片后，輕壓至標(biāo)本薄如云霧狀，吸去蓋玻片周圍溢出的多余染液。先人工熒光鏡檢，后用AFMICADS 熒光鏡檢。AFMICADS 熒光鏡檢的簡(jiǎn)要流程為：將玻片上標(biāo)本中心置于掃描鏡頭下（×200 倍），1 次掃描（25 個(gè)視野，0.202 mm2/視野）后進(jìn)行分析，分別提取并顯示概率值（可疑區(qū)域疑似為陽性的平均概率值）最高的5 個(gè)真菌成分截圖，經(jīng)人工確認(rèn)后，若為陽性結(jié)果，即給出檢驗(yàn)報(bào)告。否則逐個(gè)增加掃描次數(shù)，獲得陽性結(jié)果即止，最多增加4 個(gè)掃描。增加的掃描點(diǎn)位于初次掃描點(diǎn)的左上、左下、右上、右下，掃描范圍與初次掃描點(diǎn)相鄰，不重疊。同樣提取增加的每個(gè)掃描點(diǎn)中概率值最高的5個(gè)真菌成分截圖，一旦經(jīng)人工確認(rèn)陽性后，即給出檢驗(yàn)報(bào)告。完成5次掃描后，經(jīng)人工確認(rèn)均未見真菌成分時(shí)，結(jié)果判斷為陰性，給出檢驗(yàn)報(bào)告。分別記錄常規(guī)鏡檢及兩種熒光染色鏡檢方法檢驗(yàn)一個(gè)標(biāo)本所需時(shí)間。

標(biāo)本取材、10%KOH和熒光染色制片、常規(guī)鏡檢、培養(yǎng)鑒定由1 名經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)員單獨(dú)完成，熒光人工鏡檢和AFMICADS 熒光鏡檢由另一接受過專業(yè)培訓(xùn)的人員獨(dú)立完成。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：皮膚癬菌?。w股癬、手足癬和甲癬等）菌學(xué)診斷的陽性標(biāo)準(zhǔn)是常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)陽性（培養(yǎng)得到的菌落鑒定為皮膚癬菌時(shí)為陽性結(jié)果，僅滿足任意1 項(xiàng)即可為陽性）。對(duì)于由念珠菌感染引起的皮膚黏膜念珠菌病、非皮膚癬菌性霉菌等感染引起的淺表皮膚感染（包括非甲癬的甲真菌病、手足部感染等），菌學(xué)診斷的陽性標(biāo)準(zhǔn)是常規(guī)鏡檢和培養(yǎng)均陽性，且鏡檢所見真菌菌絲、孢子形態(tài)特征與分離培養(yǎng)所得菌株相符合。計(jì)算2種熒光鏡檢和陽性標(biāo)準(zhǔn)方法（常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)）檢測(cè)所有標(biāo)本的陽性率。以常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)陽性為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算2種熒光鏡檢方法的一致性、敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。采用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)（McNemar 檢驗(yàn)）和Kappa檢驗(yàn)，分析2種熒光鏡檢方法檢測(cè)陽性率與常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)結(jié)果間有無差異。Kappa 檢驗(yàn)所得Kappa值 ≥ 0.75 為高度一致，0.4 ～ ＜ 0.75 為中度一致，＜ 0.4 為一致性差；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。使用診斷符合率檢驗(yàn)［9］分析2種熒光鏡檢方法之間一致性有無差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

二、結(jié)果

各種鏡檢及培養(yǎng)法檢測(cè)皮屑與甲屑標(biāo)本陽性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。126份標(biāo)本中，真菌培養(yǎng)陽性59份（46.8%），菌種分別為：紅色毛癬菌45 份、犬小孢子菌2 份、指（趾）間毛癬菌2 份、白念珠菌6 份、念珠菌3 份及紅色毛癬菌與念珠菌混合感染1 份。人工熒光鏡檢陽性124 份（98.4%），AFMICDADS 熒光鏡檢陽性123 份（97.6%），常規(guī)鏡檢陽性95份（75.4%）。人工熒光鏡檢與AFMICADS熒光鏡檢陽性率均顯著高于常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)［陽性98例（77.8%），均P＜ 0.01），Kappa 值分別為0.107 和0.157（均P＜ 0.001）。見表2。

與常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)結(jié)果相比，人工熒光鏡檢的敏感性和特異性分別為100.0%和7.1%，一致性為79.4%，陽性預(yù)測(cè)值79.0%，陰性預(yù)測(cè)值100.0%；AFMICADS 熒光鏡檢的敏感性和特異性分別為100.0%和10.7%，一致性為80.2%，陽性預(yù)測(cè)值79.7%，陰性預(yù)測(cè)值100.0%（表2）。AFMICADS熒光鏡檢與人工熒光鏡檢的一致性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（診斷符合率檢驗(yàn)u=0.125，P＞ 0.05）。

常規(guī)鏡檢和人工熒光鏡檢觀察到真菌成分的時(shí)間約為1 ～2 min，200 倍鏡下掃描全片確認(rèn)無真菌的時(shí)間約為8 ～10 min。AFMICADS 完成1 次掃描需2 min，識(shí)別并輸出陽性結(jié)果的時(shí)間為3 ～5 min，識(shí)別并輸出陰性結(jié)果的時(shí)間為1 ～1.5 min。這樣AFMICADS 完成鏡檢的時(shí)間范圍最短5 min（1 次掃描，陽性結(jié)果），最長21 min（5 次掃描，陽性結(jié)果）。

三、討論

盡管顯微成像系統(tǒng)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助識(shí)別技術(shù)已用于一些常見腫瘤組織病理診斷，但尚未見將計(jì)算機(jī)輔助識(shí)別技術(shù)用于淺部真菌病臨床檢驗(yàn)的報(bào)道。M?der 等［8］使用與本研究中AFMICADS 不同的算法，即分析真菌的形態(tài)特征及直方圖特征，根據(jù)統(tǒng)計(jì)信息判斷是否有陽性感染，對(duì)淺部真菌病的臨床標(biāo)本圖像識(shí)別的敏感性和特異性分別達(dá)到了83%和79%，但尚未見該研究成果的轉(zhuǎn)化及在臨床上實(shí)際應(yīng)用效果的報(bào)道。本研究中AFMICADS系統(tǒng)采用深度語義分割算法，雖未分別識(shí)別真菌菌絲和孢子或研究分析各自的敏感性，但與M?der 等［8］使用的算法相比，AFMICADS 系統(tǒng)具有分割準(zhǔn)確、不易遺漏及敏感性更高等特點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢的一致性相當(dāng)。兩者均呈現(xiàn)出敏感性高，特異性低的特點(diǎn)。以常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)結(jié)果為參照，特異性反映的是受試方法判斷出真陰性的比例。兩種熒光鏡檢陽性率均高于常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)結(jié)果，30份按陽性標(biāo)準(zhǔn)判斷為陰性的標(biāo)本中分別有25 份和26 份被AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢判斷為陽性，從而使兩種熒光鏡檢的真陰性標(biāo)本數(shù)大幅減少，特異性明顯下降。因此，參照目前的標(biāo)準(zhǔn)得出熒光鏡檢的特異性未能客觀反映熒光鏡檢的真實(shí)特性。另外，本研究中4 種檢測(cè)方法檢測(cè)均為陰性的標(biāo)本數(shù)量少（僅1份），也在一定程度上影響了特異性的精確評(píng)估。

表1 3種鏡檢及培養(yǎng)法檢測(cè)疑似淺部真菌感染患者的皮屑及甲屑標(biāo)本中的真菌陽性率比較［陽性數(shù)（%）］

表2 疑似淺部真菌感染患者標(biāo)本3種鏡檢法真菌檢測(cè)結(jié)果比較

AFMICADS熒光鏡檢與人工熒光鏡檢均有著較高的陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。雖然兩種熒光鏡檢的特異性均低，但陽性預(yù)測(cè)值也接近80%，這與淺表皮膚真菌病患病率高，以及到醫(yī)院就醫(yī)患者中淺表皮膚真菌病患者比例較高有關(guān)。盡管淺表皮膚真菌病患病率高，但兩種熒光鏡檢的陰性預(yù)測(cè)值均高，這與兩者的敏感性高相關(guān)。此結(jié)果表明，熒光鏡檢具有良好的協(xié)助臨床診斷價(jià)值。

已有研究顯示，人工熒光鏡檢明顯優(yōu)于常規(guī)鏡檢［1-3］，其在國內(nèi)外真菌臨床檢驗(yàn)中也已被廣泛應(yīng)用多年。對(duì)于臨床淺部真菌感染標(biāo)本，AFMICADS 熒光鏡檢是取代人工熒光鏡檢的可靠方法之一，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外尚未見與AFMICADS類似的商業(yè)化診斷系統(tǒng)。

AFMICADS熒光鏡檢時(shí)，無論掃描標(biāo)本中菌量多少，均不易被遺漏，還能節(jié)省人工檢驗(yàn)時(shí)間，降低檢驗(yàn)員的勞動(dòng)強(qiáng)度。對(duì)于細(xì)小的、肉眼不易發(fā)現(xiàn)的孢子或菌絲也不易被AFMICADS 熒光鏡檢漏檢，常規(guī)鏡檢易將植物纖維和衣物纖維誤判為菌絲的情況在AFMICADS 熒光鏡檢時(shí)很少出現(xiàn)，這是該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。計(jì)算機(jī)診斷對(duì)熒光染色弱的真菌成分識(shí)別能力低，易將強(qiáng)熒光著色的背景物質(zhì)及氣泡邊緣誤判為真菌成分，且在離焦區(qū)域誤判概率較高，以至于單純依靠計(jì)算機(jī)診斷時(shí)幾乎沒有陰性結(jié)果，即特異性差。目前，在腫瘤組織病理診斷中計(jì)算機(jī)識(shí)別僅作為輔助手段。因此，本試驗(yàn)所用系統(tǒng)暫采用計(jì)算機(jī)輔助人工診斷的方法（即人機(jī)協(xié)同診斷）來提高診斷的特異性。此外，我們將通過標(biāo)準(zhǔn)化地制備樣本以減少樣本中的氣泡，并加大訓(xùn)練樣本量和/或改進(jìn)調(diào)焦算法提高采集圖像的質(zhì)量，以減少誤判。

AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢相比，速度上尚無明顯優(yōu)勢(shì)。但當(dāng)面臨大量標(biāo)本，特別是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查或疾病篩查時(shí)，人工取材和AFMICADS 熒光鏡檢能同時(shí)進(jìn)行，就會(huì)顯示出其省時(shí)、高效批量處理的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理再制片使涂片厚度趨向均一，改進(jìn)機(jī)器識(shí)別策略和算法，提高計(jì)算機(jī)性能等，均可進(jìn)一步減少耗時(shí)。此外，利用本系統(tǒng)中的熒光顯微成像系統(tǒng)便于大量采集、記錄臨床標(biāo)本中真菌形態(tài)的影像數(shù)據(jù)，為將來進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，探索機(jī)器識(shí)別鏡檢圖像即對(duì)常見致病真菌做出快速菌種鑒定創(chuàng)造條件。

本研究中淺部真菌感染標(biāo)本經(jīng)熒光染色后，無論是人工熒光鏡檢還是AFMICADS熒光鏡檢陽性率均顯著高于常規(guī)鏡檢和/或真菌培養(yǎng)結(jié)果。本研究中所使用的真菌熒光染液主要成分為與真菌細(xì)胞壁中β-多糖非特異性結(jié)合的鈣熒光白。盡管有文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道，特異性熒光染液（如熒光素標(biāo)記的重組幾丁質(zhì)酶染液）用于淺部真菌病真菌鏡檢時(shí)，檢出陽性率顯著高于常規(guī)鏡檢和鈣熒光白染色鏡檢，但鈣熒光白染色法的檢出陽性率與常規(guī)鏡檢差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［1-4］。這與本研究結(jié)果不一致，不排除受試臨床標(biāo)本種類不同、檢驗(yàn)人員技術(shù)水平不齊、所用鈣熒光白試劑來自不同廠家等因素造成的差異。與常規(guī)鏡檢相比，由于熒光染色使真菌成分易于辨認(rèn)，熒光染色鏡檢時(shí)在全片中僅見到數(shù)個(gè)出芽或未出芽孢子的情況較多見，但其是否有臨床意義尚待觀察研究。

鑒于本研究為將機(jī)器視覺用于淺部真菌病致病菌臨床鏡檢的初步嘗試，故還存在一些不足，如標(biāo)本量較少。展望未來研究工作，尚需解決標(biāo)本涂片厚度均一化的問題，進(jìn)一步增加訓(xùn)練樣本量，改進(jìn)調(diào)焦算法，提高采集圖像的質(zhì)量等，以縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高特異性，最終實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)真菌鏡檢，并用更大量的標(biāo)本進(jìn)行臨床應(yīng)用檢驗(yàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突