王方　郝歡萌　逯宜

[摘要]目的：研究胰島素對(duì)大鼠牙周膜細(xì)胞增殖及其炎性因子表達(dá)的影響。方法：分離培養(yǎng)原代大鼠牙周膜細(xì)胞，在體外高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別加入濃度為0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的胰島素，0nmol/L濃度為對(duì)照組，其余均為實(shí)驗(yàn)組，用不同濃度的胰島素處理細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)大鼠牙周膜細(xì)胞增殖水平變化;根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取25nmol/L濃度胰島素處理組為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行炎性因子表達(dá)差異研究，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)不同濃度胰島素處理后炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10的表達(dá);ELISA法檢測(cè)IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10含量;通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胰島素對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖及對(duì)牙周膜細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響。結(jié)果：與對(duì)照組相比，隨著胰島素濃度的增高，抑制作用越明顯;在mRNA水平和蛋白水平，胰島素處理的實(shí)驗(yàn)組牙周膜細(xì)胞，其炎性因子表達(dá)量均明顯增高（P<0.05）。結(jié)論：胰島素會(huì)抑制大鼠牙周膜細(xì)胞的增殖，且對(duì)牙周膜細(xì)胞的炎性因子表達(dá)有促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞]牙周膜細(xì)胞;胰島素;增殖;炎性因子;抑制作用

[中圖分類號(hào)]R329.2+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）10-0092-04

Abstract： Objective? To study the effect of insulin on the proliferation of rat periodontal ligament cells and the expression of inflammatory factors. Methods? Primary rat periodontal ligament cells were isolated and cultured in high glucose medium in vitro. The concentration of insulin was 0nmol/L， 25nmol/L， 50nmol/L and 100nmol/L. The control group was 0nmol/L. The rest were experimental groups. After treated with different concentrations of insulin， the proliferation level of rat periodontal ligament cells was detected by MTT assay. According to MTT test results， 25nmol/L insulin treatment group was selected as the experimental group， the difference of expression of inflammatory factors was studied. After treated with different concentrations of insulin， the proliferation level of rat periodontal ligament cells was detected by MTT test， and the expression of inflammatory factors IL-1β， PGE2， TNF-α， IFN-γ and IL-10 was detected by real-time quantitative RT-PCR. The contents of IL-1β， PGE2， TNF-α， IFN-γ and IL-10 were measured by ELISA. The effects of insulin on the proliferation of periodontal ligament cells and the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells were verified by the above experiments. Results? Compared with the control group， the inhibition was more obvious with the increase of insulin concentration， and the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells treated with insulin increased significantly at the level of protein and mRNA （P<0.05）. Conclusion? Insulin can inhibit the proliferation of rat periodontal ligament cells and promote the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells.

Key words： periodontal ligament cells; insulin; cell proliferation; inflammatory factors; inhibitory action

牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cell，PDLC）是牙周組織的重要組成部分，是具有多向分化潛能的一類細(xì)胞，在生物體內(nèi)發(fā)揮著多種不可替代的生物學(xué)功能[1]，也是參與牙周組織再生過(guò)程的主要細(xì)胞類型之一[2-3]。因此對(duì)牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)行為研究是近年來(lái)牙周組織健康，牙周組織再生的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[4]。本文以大鼠原代牙周膜細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外對(duì)其施加不同濃度胰島素，研究胰島素水平對(duì)大鼠PDLC細(xì)胞增殖及其炎性因子表達(dá)的影響。

1? 材料和方法

1.1 材料：DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）、PBS（Invitrogen，美國(guó)）、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素（Amersham，美國(guó)）、原代培養(yǎng)器具盒（眼科剪、眼科鑷、手術(shù)刀）、PrimeScript? RT Master Mix （Perfect Real Time）（Takara，中國(guó)）、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（Thermo Fisher，美國(guó)）。

1.2 儀器：光學(xué)顯微鏡（Leica SE，日本）、實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI7500，美國(guó)）、多孔板酶標(biāo)儀（Bio-Tech，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠原代牙周膜細(xì)胞獲取及培養(yǎng)：配置含20%胎牛血清、100mg/L青-鏈雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)組織塊法獲取大鼠原代牙周膜細(xì)胞。1周后觀察，有細(xì)胞爬出，每3d換液1次。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶37℃消化，以1：3比例傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組和處理：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代大鼠牙周膜細(xì)胞，消化細(xì)胞制成的細(xì)胞懸液，分別接種在96/24孔板中，每孔接種細(xì)胞密度分別為1×104/孔、1×105/孔，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，分別加入濃度為0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的胰島素進(jìn)行處理，隔天換液，維持培養(yǎng)液中胰島素濃度。對(duì)照組培養(yǎng)液不添加胰島素，換液頻率與實(shí)驗(yàn)組保持一致。

1.3.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：在相同培養(yǎng)條件下，分別在0d、12h、1d、2d、3d、5d、7d的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，取上述96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，在每孔加入配制好的MTT（5mg/ml）20?l，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，吸棄培養(yǎng)基后加入DMSO 100?l，避光震蕩15min，充分溶解晶狀物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490nm處的吸光度OD值，繪制不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組牙周膜細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)原代細(xì)胞炎性因子mRNA的表達(dá)：根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取25nmol/L濃度胰島素培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞，在培養(yǎng)第3天收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA，按照Takara micro RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定。炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10實(shí)時(shí)定量PCR引物序列如表1。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系（20μl）：5×SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes 4μl，10μmol/L的上、下游引物各0.2μl，cDNA模板2μl，ddH2O 13.6μl。反應(yīng)條件：94℃ 5 min;94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行歸一化處理，采用相對(duì)定量法，表達(dá)量用GAPDH的倍數(shù)表示，用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子的表達(dá)：采用ELISA試劑盒（96T，武漢華美生物） 分別對(duì)培養(yǎng)第7天培養(yǎng)液中的IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10含量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟和操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各炎性因子在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取稀釋后樣本中各細(xì)胞因子的濃度，然后再按稀釋倍數(shù)計(jì)算其實(shí)際濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠原代牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)：組織塊法培養(yǎng)1周后，用20倍顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，大鼠原代牙周膜細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。見(jiàn)圖1。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：培養(yǎng)0d、12h、1d、2d、3d、5d、7d的牙周膜細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在不添加胰島素干擾時(shí)，牙周膜細(xì)胞的增殖狀況良好，0～4d增殖速度較快，4～7d增殖趨于平穩(wěn)，給予低濃度胰島素干擾時(shí)（25nmol/L），細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），給予高濃度胰島素時(shí)（50nmol/L、100nmol/L），細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在培養(yǎng)的第2天增殖曲線就已趨于平緩。見(jiàn)圖2。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)原代細(xì)胞炎性因子mRNA的表達(dá)：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低濃度胰島素干擾時(shí)（25nmol/L），細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組明顯降低，而高濃度胰島素時(shí)（50nmol/L、100nmol/L），細(xì)胞增殖受到明顯抑制，為了避免多重因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾和影響，對(duì)炎性因子表達(dá)的研究選取低濃度胰島素（25nmol/L）刺激條件。與對(duì)照組相較，細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ在胰島素刺激下表達(dá)量均有不同程度的升高（P<0.05），與實(shí)時(shí)定量結(jié)果相符。而IL-10在細(xì)胞培養(yǎng)液中的表達(dá)略有下降。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子的表達(dá)：低濃度胰島素（25nmol/L）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相較，細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ在胰島素刺激下表達(dá)量均有不同程度升高（P<0.005），與實(shí)時(shí)定量結(jié)果相符。而IL-10在細(xì)胞培養(yǎng)液中的表達(dá)略有下降（P<0.001）。見(jiàn)圖4。

3? 討論

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是臨床上最為常見(jiàn)的牙周組織慢性炎癥性疾病，與牙周炎相關(guān)的炎性細(xì)胞因子多達(dá)數(shù)十種[5-8]。牙周膜細(xì)胞是牙周組織的重要組成部分，其生理活動(dòng)在牙周健康維持方面有不可替代的作用和生物學(xué)意義[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、PGE2均與牙周病免疫破壞密切相關(guān)，如參與刺激骨吸收，誘導(dǎo)蛋白酶產(chǎn)生，抑制膠原、非膠原的合成[10-11]。也有證據(jù)表明牙周炎模型大鼠的IL-1β、PGE2水平均明顯高于健康大鼠，在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中，其濃度隨著牙周炎癥程度的加重而相應(yīng)增高[12]，IL-1β、PGE2在一定程度上又可以促進(jìn)炎癥發(fā)展。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果顯示IL-10的水平與牙周炎呈負(fù)相關(guān)，提示IL-10在牙周炎癥組織中可能是一種抗炎因子[13]。此外Carey、Yeganegi等人的研究也證實(shí)IL-10濃度升高可抑制免疫活性細(xì)胞表達(dá)及分泌炎癥細(xì)胞因子，從而抑制炎癥反應(yīng)[14-15]。

炎癥是糖尿病和牙周炎的共同病理基礎(chǔ)[16]，糖尿病患者體內(nèi)的胰島素水平紊亂，在一定程度上加重了患者患牙周炎/慢性牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)[17]，與此同時(shí)，牙周組織細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，使二型糖尿病患者的血糖水平得不到有效的控制[18]。在體內(nèi)，牙周組織周圍炎性因子的來(lái)源一部分是牙周感染過(guò)程中產(chǎn)生的，隨牙周破損潰爛進(jìn)入到體內(nèi)循環(huán)，進(jìn)一步引起全身性的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在一定程度上能夠促使糖尿病患者產(chǎn)生胰島素抵抗癥狀[19]。文獻(xiàn)研究同時(shí)證實(shí)牙周感染可反作用于血糖控制，導(dǎo)致牙周病和糖尿病兩者之間出現(xiàn)惡性循環(huán)[20]。但胰島素濃度水平的高低對(duì)牙周細(xì)胞本身是否存在影響尚未見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合上述已有的文獻(xiàn)研究，本文將研究目標(biāo)鎖定在體外胰島素水平對(duì)牙周膜細(xì)胞生理活動(dòng)的影響，主要以牙周膜細(xì)胞及其炎性因子表達(dá)水平為表征手段，觀察在正常培養(yǎng)條件下，不同濃度胰島素對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖和炎性因子表達(dá)水平的影響。相較于體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，體外環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響是相對(duì)獨(dú)立和有針對(duì)性的，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上盡可能少的引入能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素，因此，筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅在一定胰島素濃度范圍內(nèi)觀察了牙周膜細(xì)胞生理活動(dòng)的影響，在實(shí)驗(yàn)限定條件下反映胰島素與牙周膜細(xì)胞之間的單向作用關(guān)系。

與對(duì)照組相比，在0～100nmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著胰島素濃度的增高，胰島素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低濃度胰島素干擾時(shí)（25nmol/L），細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組明顯降低，而高濃度胰島素時(shí)（50nmol/L、100nmol/L），細(xì)胞增殖受到明顯抑制，為了避免多重因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾和影響，對(duì)炎性因子表達(dá)的研究選取低濃度胰島素（25nmol/L）刺激條件。在mRNA水平和蛋白水平，胰島素處理的實(shí)驗(yàn)組牙周膜細(xì)胞，其炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ表達(dá)量均明顯增高，對(duì)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)無(wú)顯著影響，與對(duì)照組相比在mRNA水平無(wú)明顯差異，在蛋白水平略有下降。因此，筆者得出以下結(jié)論：胰島素濃度小于100nmol/L時(shí)，胰島素濃度的增高會(huì)抑制大鼠牙周膜細(xì)胞的增殖，低濃度胰島素（25nmol/L）對(duì)牙周膜細(xì)胞的促炎性因子表達(dá)有促進(jìn)作用。

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[收稿日期]2019-07-12

本文引用格式：王方，郝歡萌，逯宜.胰島素對(duì)大鼠牙周膜細(xì)胞增殖及其炎性因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（10）：92-95.