白雅竹，鄭志忠，陳清智，黃 雯，陳良華，林河通，明艷林,,

(1.廈門華僑亞熱帶植物引種園／廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室，福建 廈門 361002；2.福建省亞熱帶植物研究所／福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002；4.福州理工學(xué)院文理學(xué)院，福建 福州 350506)

非洲馬鈴果Voacanga africana 又名非洲伏康樹、非洲沃坎加樹，是一種原產(chǎn)于西非的夾竹桃科植物[1]。非洲馬鈴果具有悠久的藥用歷史，主要用于治療麻風(fēng)病、痢疾、全身性水腫、小兒驚厥、癲癥、利尿劑，也有一定的戒毒藥理活性[2—3]。因此，近年來非洲馬鈴果的應(yīng)用價值，尤其是其中吲哚類生物堿的應(yīng)用價值，受到越來越廣泛的關(guān)注[4—6]。

非洲馬鈴果含有多種吲哚生物堿[7]，其中含量較高的是長春胺(Vincamine)、冠狗牙花定堿(Coronaridine)、老刺木胺(Voacamine)、伏康京堿(Voacangine)。有研究證實其對腫瘤細(xì)胞增殖具有一定的抑制效果，如老刺木胺對肺癌、前列腺癌，伏康京堿對前列腺癌都表現(xiàn)出較好的抑制效果[8—9]；冠狗牙花定堿能抑制人乳腺癌細(xì)胞系BCAP 細(xì)胞株的增殖；長春胺可作為治療癌癥的臨床用藥，其作用機制與陽離子相似，能絡(luò)合多種蛋白質(zhì)使其形成沉淀，從而達(dá)到抗腫瘤的作用[10]。另有研究表明，非洲馬鈴果樹皮水-醇提取物與烏口樹屬、九節(jié)屬植物的提取物相比，前者更具顯著減緩阿爾茲海默癥(AD)的療效，提取物中含有的生物堿老刺木胺在低劑量下表現(xiàn)出顯著的抗氧化性(EC50≤3.4 μmol·L-1)[11]。另有文獻(xiàn)指出，非洲馬鈴果浸提物具有抗分枝桿菌(mycobacterial)和膽堿酯酶(cholinesterase)等活性[12]。

本課題組前期已在廈門成功馴化從非洲加納引種的非洲馬鈴果，并對其種子的吲哚類生物堿進(jìn)行系列研究，從中提取分離鑒定出長春胺、冠狗牙花定堿、老刺木胺和伏康京堿4 種吲哚類生物堿[13—14]。為進(jìn)一步檢測非洲馬鈴果中這4 種吲哚類生物堿的體外抗腫瘤效果，本研究以細(xì)胞形態(tài)變化和藥物對體外細(xì)胞的增殖抑制率為指標(biāo)，通過方便、簡潔、經(jīng)濟的MTT 法、AO/EB 染色法等方法進(jìn)行研究，為非洲馬鈴果的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品長春胺、冠狗牙花定堿、老刺木胺、伏康京堿、紫杉醇，購自上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%；噻唑藍(lán)(MTT)、吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)、二甲基亞砜(DMSO)，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 供試細(xì)胞株

人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)、人肝癌細(xì)胞(BEL7402、SMMC7721)、正常人肝細(xì)胞(Changliver)，均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制 將MTT 粉末溶于磷酸緩沖液(PBS)中配置成5 mg·mL-1溶液，用0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃避光冷藏。熒光染色液：0.5 g·mL-1AO、0.5 mg·mL-1EB 等體積混勻，用0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃避光冷藏。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)四株細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)PBS 沖洗，0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，用血球計數(shù)板測定細(xì)胞懸液濃度，根據(jù)每孔2500 個細(xì)胞的量，吸取相應(yīng)體積細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)體積，充分混勻接種于96 孔板；每孔中加入100 μL 稀釋好的細(xì)胞懸液平鋪至孔底，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 MTT 法 測定方法在司金光等[15]方法的基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整。取1.3.2 細(xì)胞，加入一系列不同濃度梯度的藥物培養(yǎng)基200 μL(濃度梯度為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL)繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)置空白對照組和陽性對照組。藥物處理48 h 后，每孔加20 μL MTT (5 mg·mL-1)后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h 后終止培養(yǎng)；棄上清液，每孔加入200 μL DMSO 使反應(yīng)產(chǎn)物溶解，用微孔板快速振蕩器振蕩10 min；于酶標(biāo)儀570 nm 處檢測吸光度值，并記錄統(tǒng)計數(shù)據(jù)。所有試驗重復(fù)三次，計算各個孔藥物對細(xì)胞的增殖抑制率，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.4 吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)雙染 參考文獻(xiàn)[16]方法并作適當(dāng)調(diào)整。取1.3.2 備用細(xì)胞，加入一系列不同濃度梯度的藥物培養(yǎng)基200 μL(濃度梯度為0、12.5、25、37.5、50 μg·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)置陰性對照組和陽性對照組。藥物處理48 h 后，吸去培養(yǎng)基，加100 μL 熒光染色液避光染色5 min，用PBS清洗2 次，熒光顯微鏡下觀察拍照，隨機取5 個視野，分別計數(shù)呈綠色熒光和橙紅色熒光的細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。凋亡率=橘紅色細(xì)胞的數(shù)量÷視野總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

圖1 顯示，藥物處理48 h 后，空白對照組的BEL7402、SMMC7721、Changliver、SKOV3 細(xì)胞均單層貼壁生長，細(xì)胞數(shù)量多且形狀飽滿，大小均一，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核明顯，形態(tài)良好。相比于空白對照組，12.5 μg·mL-1老刺木胺作用的四株細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，體積縮小，細(xì)胞皺縮變圓，部分細(xì)胞間連接變小，貼壁不緊，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，與2 μg·mL-1紫杉醇陽性對照組的細(xì)胞形態(tài)特征及凋亡相似。50 μg·mL-1伏康京堿處理后，BEL7402、Changliver 細(xì)胞也有同樣的變化，并且出現(xiàn)少量大小不等的細(xì)胞碎片，但SKOV3、SMMC7721 細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。而經(jīng)50 μg·mL-1長春胺和冠狗牙花定堿處理的四株細(xì)胞未見顯著變化。

圖1 四種藥物對四株細(xì)胞株作用48 h 后的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of four cell lines treated with four drugs for 48 h

2.2 MTT 結(jié)果

不同類型吲哚類生物堿在體外對四株細(xì)胞株均有不同程度的抑制作用。老刺木胺對四株細(xì)胞株的增長抑制效果如圖2: A 所示，對數(shù)生長期的不同細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理后，細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)藥物濃度達(dá)50 μg·mL-1時，對四株細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)96%以上。伏康京堿對四株細(xì)胞株的增長抑制效果如圖2: B 所示，低濃度時，該生物堿對四株細(xì)胞株未見明顯的細(xì)胞毒作用，濃度達(dá)到50 μg·mL-1時，對BEL7402 和Changliver 細(xì)胞株的增殖抑制率達(dá)78%以上。長春胺對各細(xì)胞株沒有明顯的細(xì)胞毒作用(圖2: C)。冠狗牙花定堿作用于SKOV3 和BEL7402 細(xì)胞株未見明顯細(xì)胞毒作用；其濃度達(dá)50 μg·mL-1時對SMM7721 和Changliver 細(xì)胞株具低細(xì)胞毒作用，抑制率分別為38.0%和55.2%(圖2: D)。由此可知，四種吲哚類生物堿對各腫瘤細(xì)胞具有不同的抑制效果，這種差異性可能與它們在上述濃度條件下各自的活性有關(guān)[17]。

圖2 四種吲哚生物堿對癌細(xì)胞的體外增殖抑制效果(48 h)Fig. 2 Inhibitory effects of indole alkaloids on proliferation of cancer cells in vitro for 48 h A.老刺木胺；B.伏康京堿；C.長春胺；D.冠狗牙花定堿

2.3 AO/EB 法染色結(jié)果

AO 能夠穿過正常細(xì)胞膜使DNA 染色而使細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，EB 只能穿過細(xì)胞膜受損的細(xì)胞使DNA 染色而使細(xì)胞核呈現(xiàn)橘紅色熒光。因此，AO/EB 雙染后正常細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)橘紅色熒光。

AO/EB 染色凋亡分析如圖3 所示。對照組細(xì)胞中心的核染色質(zhì)均呈現(xiàn)均勻、黃綠色的熒光，未見凋亡細(xì)胞；老刺木胺作用組在所示濃度下，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈現(xiàn)黃綠色熒光，并且濃聚成顆粒狀，位于細(xì)胞的一側(cè)，說明細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]，表明該藥物對四株細(xì)胞均有較強的毒性作用。在圖示濃度下，伏康京堿作用BEL7402、Changliver 部分細(xì)胞核顯示橘黃色或紅色濃集熒光或熒光減弱，呈現(xiàn)一定的細(xì)胞凋亡形態(tài)。但長春胺組和冠狗牙花定堿組未見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

凋亡率統(tǒng)計顯示，12.5 μg·mL-1老刺木胺對四株細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用最大，接近100%；50 μg·mL-1長春胺和冠狗牙花定堿對細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡率低；50 μg·mL-1伏康京堿對BEL7402、Changliver 具有一定誘導(dǎo)凋亡率，而對另外兩株細(xì)胞無明顯的誘導(dǎo)作用(圖4)。

圖3 熒光顯微鏡下四種吲哚類生物堿對四株細(xì)胞的作用形態(tài)Fig. 3 The morphology of four cell lines induced by four indole alkaloids under a fluorescence microscope

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的常見病。腫瘤細(xì)胞特殊的生理學(xué)結(jié)構(gòu)及其不定向的轉(zhuǎn)移，使得傳統(tǒng)的手術(shù)、化療等治療方法不能取得令人滿意的療效。找尋高療效、低毒性乃至無毒性的化合物一直都是腫瘤藥物研發(fā)的主要目標(biāo)。非洲馬鈴果作為一種具有長久藥用歷史的熱帶植物，自20 世紀(jì)50 年代以來，已有不少國內(nèi)外研究者對其生物活性成分進(jìn)行開發(fā)利用，就目前看來，其內(nèi)除含有生物堿之外，也有不少的揮發(fā)油類化合物、黃酮類等其他化學(xué)成分[18]。

本文比較了非洲馬鈴果中4 種吲哚類生物堿的體外抗腫瘤效果。MTT 方法結(jié)果顯示，50 μg·mL-1老刺木胺對四株腫瘤細(xì)胞均有超過95%的抑制率；而相同濃度的伏康京堿僅對Changliver 和BEL7402 有超過78%的抑制率；長春胺和冠狗牙花定堿對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果不明顯。經(jīng)AO/EB 雙染色顯示，4 種生物堿中僅有老刺木胺對腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制效果，能使細(xì)胞核出現(xiàn)濃聚和偏移現(xiàn)象。老刺木胺對正常肝細(xì)胞Changliver 同樣具有較強的抑制作用，使得老刺木胺在抗腫瘤藥物制備應(yīng)用中受到很大局限，因此可以考慮對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行過修飾，從而達(dá)到降低對正常細(xì)胞的毒副作用，類似紫杉醇和多烯紫杉醇。本研究僅局限在非洲馬鈴果中吲哚類生物堿的體外抗腫瘤活性上，其抗腫瘤機理有待進(jìn)一步研究。

圖4 四種吲哚類生物堿對四株細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡率Fig. 4 The induction rate of apoptosis by four indole alkaloids in four cell lines