李惠華，曾碧玉

(福建省亞熱帶植物研究所／福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361006)

金線蓮Anoectochilus roxburghii 又稱金線蘭，系蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，《中國(guó)植物志》記載該屬有20 種和2 變種[1]。金線蓮是民間珍稀藥草，廣泛用于治療炎癥和熱癥[2]。研究表明，金線蓮富含多糖、氨基酸、微量元素、強(qiáng)心苷類、有機(jī)酸、甾體化合物、黃酮類化合物、生物堿等成分，其中多糖、多酚、黃酮為其主要活性成分，是評(píng)價(jià)金線蓮品質(zhì)的主要指標(biāo)，具有抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、增強(qiáng)免疫等廣泛生物活性[3—4]。不同地理種源金線蓮的活性成分含量存在差異，林麗清等[5]測(cè)得廣西金線蓮粗多糖生藥含量為37.45%，多糖含量在金線蓮中較高[6]。廣西金線蓮葉面大、植株大，是主要的栽培銷售種源。

目前，金線蓮的研究多集中于組織培養(yǎng)技術(shù)、栽培管理技術(shù)、化學(xué)成分及其藥理作用 。采收期是果蔬以及藥材品質(zhì)的重要影響因子[8]。然而，目前金線蓮的采收尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可依。市面上不同移栽階段的金線蓮均有出售，但多以室外移栽90～120 d 或180 d 的金線蓮居多?？梢?，系統(tǒng)研究金線蓮不同移栽階段的生物量及活性成分的變化規(guī)律具有重要意義。至今，金線蓮不同采收時(shí)期生物量及活性成分的系統(tǒng)研究甚少[9—11]。本研究選用市場(chǎng)銷售較多的廣西金線蓮為研究對(duì)象，對(duì)其不同移栽階段的生物學(xué)性狀、生物產(chǎn)量及主要活性成分多糖、多酚、黃酮含量進(jìn)行評(píng)估，以期為金線蓮活性成分開發(fā)利用、采收適期的確定以及不同種源金線蓮的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為廣西金線蓮(圖1)，經(jīng)林文革高級(jí)工程師鑒定。移栽種植實(shí)驗(yàn)在廈門地緣生物科技有限公司(福建廈門)大棚內(nèi)進(jìn)行。地處118°01′E，24°46′N，屬亞熱帶海洋性氣候，年均溫20.5 ℃，年均降雨量1234 mm。大棚為簡(jiǎn)易大棚，采用聚乙烯薄膜，外層加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，光照3000～3500 lx，溫度控制在15～30 ℃，相對(duì)濕度75%～85%。

圖1 廣西金線蓮Fig. 1 Anoectochilus roxburghii from Guangxi

1.2 試劑與儀器

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及福林酚試劑(美國(guó)Sigma 公司)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(天津一方科技有限公司)；95%乙醇、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉及亞硫酸鈉購(gòu)自國(guó)藥試劑公司；分析級(jí)粉碎機(jī)(A11)(德國(guó)IKA 集團(tuán))，紫外/可見光光譜儀(Lambda 25)(美國(guó)PERKINELMER 股份有限公司)，恒溫培養(yǎng)振搖器(ZWYR-2102)(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 生物學(xué)性狀調(diào)查 移栽苗(組織培養(yǎng)滿180 d)由廈門地緣生物科技有限公司提供。移栽培養(yǎng)缽口徑8 cm，培養(yǎng)基質(zhì)為植物腐殖質(zhì)40%、泥炭土25%、珍珠巖25%、細(xì)沙10%，每缽種植1 株金線蓮。常規(guī)栽培管理。

定植后，采收4～9 月齡金線蓮。采收后，隨機(jī)挑選15 株進(jìn)行生物學(xué)性狀及生物量調(diào)查。軟尺測(cè)量莖高(頂芽抽出處至莖基部長(zhǎng)度)，數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗(莖最粗處直徑大小)。選取植株最大展開葉片，用軟尺測(cè)量葉長(zhǎng)及葉寬。計(jì)算植株葉片數(shù)，并測(cè)定單株鮮重及干重。單株鮮重為單株材料清洗干凈并擦拭干水分后稱重所得；單株干重為測(cè)定鮮重后于50 ℃烘箱烘干至恒重。

1.3.2 活性成分提取 金線蓮采收后，用流水沖洗蒸餾水潤(rùn)洗，50 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎并過40 目篩，得到干燥粉末，密封-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

稱取500 mg 金線蓮干燥粉末，按1:60(W/V)料液比加入60%乙醇溶液，于搖床中120 r·min-1、25 ℃振搖48 h，過濾取濾液并定容，供總多酚及總黃酮含量測(cè)定。濾渣進(jìn)一步按1:60(W/V)料液比加入蒸餾水，60 ℃水浴1.5 h，過濾，取濾液并定容，供總糖與還原糖含量測(cè)定。

1.3.3 活性成分測(cè)定

1.3.3.1 多糖含量測(cè)定 多糖含量根據(jù)公式多糖含量(mg·g-1DW) = 總糖含量-還原糖含量計(jì)算?？偺桥c還原糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法與3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定，參考曾碧玉等[12]方法。

1.3.3.2 總多酚含量測(cè)定 參照Z(yǔ)uo 等[13]所述方法并加以修改。

標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液配制(5.00 mg·mL-1)：精確稱取沒食子酸500 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100 倍后得到50 μg·mL-1沒食子酸溶液。在各比色管中，分別吸入0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL 沒食子酸溶液，補(bǔ)足蒸餾水至2.00 mL，混勻。每管再分別加入1.00 mL 福林酚試劑，混勻后反應(yīng)4 min。各管中再分別加入1.00 mL Na2CO3溶液(10%)，避光室溫條件下靜置2 h。以蒸餾水為參比，于765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。每管各測(cè)3 次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0246 x，R2= 0.9980。其中，x 為沒食子酸含量(μg)，y 為吸光度值。

樣品含量測(cè)定：取1.00 mL 樣品溶液，同上法操作，測(cè)定吸光度值，按所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品總多酚含量(mg·g-1DW)。

1.3.3.3 總黃酮含量測(cè)定 參照Sheng 等[14]方法并略加修改。

標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液配制(100 μg·mL-1)：精確稱取10 mg 蘆丁(105 ℃干燥至恒重)，加適量60%乙醇，水浴加熱溶解，待冷卻后，用60%乙醇定容至100 mL，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：于具塞試管中，分別加入0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別補(bǔ)加60%乙醇至5.00 mL，混勻；分別加300 μL NaNO2溶液(5%)，混勻反應(yīng)6 min；再分別添加300 μL Al(NO3)3溶液(10%)，混勻靜置反應(yīng)6 min；然后，分別加4.00 mL NaOH 溶液(1 mol·L-1)，混勻；最后，分別加400 μL 60%乙醇溶液，搖勻。放置10 min 后，以60%乙醇為參比，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。每管均測(cè)3 次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.8655x，R2=0.9999。其中，x 為蘆丁含量(mg)，y 為吸光度值。

樣品含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取1.00 mL 樣品溶液，操作步驟同上，測(cè)定吸光度值，按上述方程計(jì)算樣品總黃酮含量(mg·g-1DW)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生物學(xué)性狀與活性成分測(cè)定數(shù)據(jù)分別為15 次與3 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。方差分析采用SPSS 11.5 軟件的One-Way ANOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同移栽月齡廣西金線蓮生物學(xué)性狀

廣西金線蓮不同移栽月齡生物學(xué)性狀如表1。4～9 月齡葉數(shù)3.1～4.1 片；最大葉葉長(zhǎng)3.91～4.45 cm、葉寬2.67～3.00 cm；莖高8.81～10.32 cm，莖粗3.21～3.42 mm；根數(shù)1.5～2.3，最長(zhǎng)根長(zhǎng)2.82～3.93 cm。

表1 廣西金線蓮不同移栽月齡生物學(xué)性狀Table 1 Biological characters of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

廣西金線蓮不同移栽月齡生物產(chǎn)量見表2。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，單株鮮重及干重呈曲折上升趨勢(shì)。9 月齡鮮重及干重最高，分別為2.470 g 及0.2033 g。不同移栽月齡折干率也有所差異，9 月齡折干率最小，為12.52%。綜合比較，9 月齡生物產(chǎn)量最高。

表2 廣西金線蓮不同移栽月齡生物產(chǎn)量Table 2 Biomass of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

2.2 不同移栽月齡多糖含量的變化

廣西金線蓮移栽后，4～9 月齡多糖含量呈先下降后上升的趨勢(shì)(圖2: A)。4 月齡多糖含量最高，為10.46 mg·g-1；隨后，多糖含量隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，7 月齡最低；到9 月齡時(shí)，多糖含量升至10.13 mg·g-1，與4 月齡相比無(wú)顯著差異。

2.3 不同移栽月齡多酚含量的變化

廣西金線蓮移栽4～6 個(gè)月，多酚含量不斷上升，6 月齡多酚含量最高，為9.49 mg·g-1；隨后緩慢下降后又上升，9 月齡多酚含量為9.41 mg·g-1，與6 月齡無(wú)顯著差異(圖2: B)。

2.4 不同移栽月齡總黃酮含量的變化

廣西金線蓮不同移栽月齡的總黃酮含量如圖2: C 所示。隨著移栽時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮含量先降后升再趨于平穩(wěn)。5 月齡黃酮含量最低；6 月齡黃酮含量最高(3.80 mg·g-1)，但與7～9 月齡黃酮含量無(wú)顯著差異。

圖 2 廣西金線蓮移栽不同月齡多糖、多酚、黃酮含量動(dòng)態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of polyphenos, polysaccharides and flavonoids of Anoectochilus roxburghii from Guangxi at different months after transplantation

3 討論

多糖、多酚及黃酮是金線蓮的重要活性成分，其含量是評(píng)價(jià)金線蓮品質(zhì)的重要指標(biāo)。前人研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮在移栽滿120 d 時(shí)總黃酮含量高于移栽0 d 的植株；而多糖含量則相反，移栽0 d 的植株較高[8,15—16]。本研究中，廣西金線蓮總黃酮6 月齡最高，但與7～9 月齡無(wú)顯著差異；多糖含量變化趨勢(shì)為先下降后上升，近似“V”字型，4 月齡含量最高，7 月齡最低，9 月齡與4 月齡無(wú)顯著差異；此外，總多酚含量6 月齡最高。因此，若以收獲總多酚或總黃酮為目的，可選用6 月齡移栽苗；但若以收獲多糖為目的，可直接選用4 月齡移栽苗。生物量是金線蓮經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)之一。本研究中，廣西金線蓮生物量以9 月齡最高。隨著不同移栽月齡的增加，人工栽培階段的成本和病蟲害危害的可能性增加，結(jié)合生物量、多糖、多酚及黃酮的變化趨勢(shì)，認(rèn)為移栽6 個(gè)月為廣西金線蓮最佳采收期。