林斯麗 段 華

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院(100006)

子宮腺肌病(ADS)是一種雌激素依賴型婦科常見疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清，但子宮內(nèi)膜細(xì)胞侵襲遷移能力的增加被認(rèn)為在ADS發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。透明質(zhì)酸合成酶(HAS)廣泛參與癌癥細(xì)胞的侵襲遷移、組織損傷的修復(fù)及炎癥反應(yīng)等[2]。透明質(zhì)酸受體CD44與透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合可激活多種下游信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。ADS雖是一種良性疾病，卻具有侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。近來(lái)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與ADS子宮內(nèi)膜侵襲遷移的研究備受關(guān)注[3-4]，而HAS和CD44與EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。目前，有關(guān)HAS與ADS的研究鮮有報(bào)道， 且CD44與ADS的研究也未曾與HAS有過(guò)關(guān)聯(lián)。本研究檢測(cè)HAS及CD44在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性，分析雌激素對(duì)其影響，探討其在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選取2017年10月—2018年9月在本院手術(shù)治療的ADS患者21例(ADS組)，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，年齡(44.2±2.6)歲，收集其在位子宮內(nèi)膜。選擇同期因子宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)行全子宮切除術(shù)且無(wú)子宮內(nèi)膜病變的患者19例為對(duì)照組，年齡(43.0±2.4)歲，收集其子宮內(nèi)膜組織。兩組對(duì)象月經(jīng)規(guī)律，未合并其他內(nèi)外科疾病，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受激素類藥物治療。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1組織取材刮取ADS在位內(nèi)膜組織，置于4℃生理鹽水中，用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離及培養(yǎng)。

1.2.2子宮內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)將獲得的子宮內(nèi)膜組織剪粉碎(<1mm)，用膠原酶I消化30 min，經(jīng)100 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾,去除未消化的組織。1000g離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)基(0.5%FBS)洗滌1次，離心后棄上清。細(xì)胞沉淀中加入含5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞打散為均勻懸浮液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待90%～95%細(xì)胞融合，消化傳代。子代經(jīng)形態(tài)經(jīng)電鏡鑒定確定為上皮細(xì)胞后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面積的80%時(shí)，予以無(wú)酚紅無(wú)血清培養(yǎng)基同步化48 h，然后分別以0、0.1、1.0、10.0 nmol/L 17β-雌二醇(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)作用子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞RNA。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)HAS各亞型及CD44 mRNA的表達(dá)提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。HAS1、HAS2、HAS3和CD44及內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH)基因序列通過(guò)Gene Bank獲得。引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物科技有限公司完成，引物序列見表1。確認(rèn)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，由Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)分析結(jié)果，自動(dòng)計(jì)算出目的基因mRNA的表達(dá)。

表1 HAS各亞型和CD44的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜組織中HAS各亞型和CD44表達(dá)

ADS組HAS2和CD44 mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組，而HAS1和HAS3 mRNA的表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)，見表2。ADS組HAS2與CD44表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.797，P<0.0001)，見圖1。

2.2 雌激素對(duì)HAS2和CD44的調(diào)節(jié)作用

ADS組HAS2的表達(dá)與17β-雌二醇呈濃度依賴型上升，與未用藥0 nmol/L比較有差異(t=2.647、5.448、8.644，P<0.05)，見表3。1.0 nmol/L 17β-雌二醇使對(duì)照組HAS2 mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著上升，與未用藥比較有差異(t=5.643，P<0.05)；而0.1、10.0 nmol/L濃度的17β-雌二醇未能上調(diào)對(duì)照組HAS2 mRNA的表達(dá)，與未用藥比較均無(wú)差異(P>0.05)。對(duì)照組僅10.0 nmol/L 17β-雌二醇干預(yù)后CD44 mRNA的表達(dá)量上調(diào)，與未用藥比較有差異(t=3.426，P<0.05)，見表3。ADS組1.0、10.0 nmol/L濃度的17β-雌二醇可顯著上調(diào)CD44 mRNA表達(dá)量，與未用藥比較均有差異(t=3.141、4.892，P<0.05)。

表2 兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞HAS各亞型和CD44 mRNA表達(dá)水平

表3 不同濃度17β-雌二醇作用后兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞 HAS2和CD44 mRNA的表達(dá)

*與0 nmol/L比較P<0.05

圖1 ADS組子宮內(nèi)膜細(xì)胞HAS2與CD44表達(dá)相關(guān)性

3 討論

3.1 ADS子宮內(nèi)膜過(guò)表達(dá)HAS2

HAS2是HAS家族亞型(HAS1、HAS2和HAS3)之一，合成的HA的分子量最大，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移進(jìn)程中有重要作用。研究表明，多種惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)過(guò)表達(dá)HAS2，調(diào)控細(xì)胞的浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[7]。ADS雖是一種良性疾病，卻具有侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，在正常子宮內(nèi)膜組織中存在3種HAS亞型的表達(dá)，且HAS2的表達(dá)最為顯著，ADS子宮內(nèi)膜HAS2發(fā)生異常高表達(dá)。提示HAS2可能對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的提高有一定的調(diào)控作用。

3.2 ADS子宮內(nèi)膜HAS2/HA/CD44軸的異常激活

CD44是一種參與細(xì)胞間相互作用、粘附和遷移的細(xì)胞表面糖蛋白，也是參與HA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最常見的受體。臨床上CD44的過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ADS組子宮內(nèi)膜CD44表達(dá)明顯增加，異常表達(dá)的CD44與HAS2表達(dá)水平呈正相關(guān)。既往研究表明，CD44與HA結(jié)合可通過(guò)激活局部粘著斑激酶、絲裂原活化蛋白激酶和Rho激酶下游靶點(diǎn)等多種途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[9]。由此推測(cè)，在ADS中HAS2可能通過(guò)合成大量HA，HA作用于其受體CD44并激活下游多種信號(hào)通路參與ADS發(fā)生發(fā)展。

研究人員經(jīng)過(guò)免疫組化檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜及ADS的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織中E-cadherin，CD44v6的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ADS異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中E-cadherin的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，CD44v6的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[10]。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞粘附因子，E-cadherin表達(dá)的損失會(huì)觸發(fā)EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。可見，CD44v6的表達(dá)與子宮腺肌病EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CD44v6是CD44變體之一，子宮腺肌病中HAS2/HA/CD44激活的下游信號(hào)通路是否通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 ADS子宮內(nèi)膜局部高濃度雌激素上調(diào)HAS/HA/CD44軸的表達(dá)

本研究結(jié)果顯示，使用中、高濃度(1.0、10.0 nmol/L)的17β-雌二醇作用于ADS組子宮內(nèi)膜細(xì)胞后CD44 mRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照組CD44 mRNA表達(dá)僅高濃度17β-雌二醇干預(yù)后發(fā)生上調(diào)。提示兩組子宮內(nèi)膜細(xì)胞CD44的表達(dá)對(duì)雌激素的反應(yīng)有所不同，ADS組對(duì)雌激素的反應(yīng)性更高。此外，ADS組子宮內(nèi)膜HAS2的表達(dá)與17β-雌二醇呈濃度依賴型增高，而對(duì)照組僅對(duì)中濃度的17β-雌二醇有明顯的反應(yīng)性，而高濃度的17β雌二醇對(duì)正常子宮內(nèi)膜HAS2的表達(dá)顯示一定的抑制作用。提示正常子宮內(nèi)膜對(duì)高濃度雌激素有一定的抵抗作用，而ADS組子宮內(nèi)膜失去了此保護(hù)機(jī)制。子宮腺肌病是一種雌激素依賴性疾病，雌激素誘導(dǎo)的EMT在子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。研究表明，ADS血清17β-雌二醇水平與在位和病變子宮內(nèi)膜的上皮組分中的E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[11]。雌激素可誘導(dǎo)EECs發(fā)生成纖維細(xì)胞樣表型的形態(tài)學(xué)變化，并通過(guò)上調(diào)Slug的表達(dá)，引發(fā)從上皮標(biāo)志物表達(dá)向間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的轉(zhuǎn)變，增加遷移和侵襲的能力[11]。由此推斷，在ADS子宮內(nèi)膜中高濃度的雌激素可能通過(guò)表達(dá)HAS2和CD44，導(dǎo)致機(jī)體合成大量HA，參與ADS子宮內(nèi)膜EMT過(guò)程。

本研究對(duì)ADS子宮內(nèi)膜細(xì)胞HAS2和CD44的表達(dá)進(jìn)行了分析，從體外細(xì)胞培養(yǎng)的角度驗(yàn)證了HAS2和CD44在ADS的高表達(dá)，且對(duì)不同濃度雌激素的反應(yīng)性，一定程度上解釋了ADS子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的原因，為后續(xù)ADS的研究提供方向。 HAS2與ADS發(fā)病機(jī)制關(guān)系的報(bào)道較少，本研究只是初步探索，對(duì)HAS2功能的研究以及與ADS發(fā)病的因果關(guān)系將是今后研究的重點(diǎn)。