王婧吉，吳生兵，王 堃，楊 超，程紅亮

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，安徽 合肥 230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指因腦血管病變造成腦組織血流運(yùn)行障礙，引起記憶、認(rèn)知和行為改變的腦區(qū)低灌注性血管疾病，是一種慢性進(jìn)行性疾病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙綜合征[1]。目前VD被認(rèn)為是唯一可以防治的癡呆類型，但發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[2]。有研究認(rèn)為VD和阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)有著共同的腦血管內(nèi)皮損傷機(jī)制以及有神經(jīng)毒性的β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在腦血管和腦實質(zhì)中積蓄[3]。Aβ跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過存在于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)膜上晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(low density lipopro-tein-receptor related protein-1，LRP-1)受體系統(tǒng)完成，其中LRP-1介導(dǎo)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)出腦，而RAGE介導(dǎo)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)入腦[4]。既往學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可改善和延緩VD患者臨床癥狀，調(diào)控與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)神經(jīng)肽物質(zhì)，促進(jìn)血管新生，調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)[5-7]。本研究觀察艾灸督脈組穴對VD大鼠BMECs的RAGE和LRP-1表達(dá)的影響，探討艾灸督脈組穴治療VD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。室溫為20～25 ℃，相對濕度為40%～75%，晝夜明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行Morris水迷宮篩選實驗，訓(xùn)練過程中對反應(yīng)過于敏感或遲鈍的大鼠予以篩除。選擇性格活潑及水迷宮實驗數(shù)據(jù)相近者36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常組、模型組和艾灸組各12只。實驗手術(shù)中死亡大鼠未列入實驗分析對象。實驗過程中對動物的處置遵循中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑及儀器 清艾條(規(guī)格：8 mm×15 mm)：南陽艾灸廠；LRP-1抗體：美國Santa Cruz；RAGE抗體：英國Abcam；通用型二步法檢測試劑盒、DAB顯色劑、PBS、EDTA修復(fù)液：北京中杉；蘇木素：珠海貝索；Morris水迷宮：安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；切片機(jī)(Leica 2135)：德國；顯微鏡(Nikon 80i)：日本。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法與模型評價 模型組和艾灸組大鼠采用頸總動脈結(jié)扎反復(fù)缺血再灌注法復(fù)制模型(經(jīng)典的VD模型制備方法)，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，無菌操作，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，并套以4號絲線備用，拉緊絲線扣，阻斷血流20 min，同時尾部放血0.3 mL，熱凝止血，松開絲線扣，恢復(fù)血流10 min，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，第3次血流在灌注后30 min，如呼吸、心跳正常，即可縫合皮膚。在模型復(fù)制完成后第4天進(jìn)行行為學(xué)評分，以鑒定模型復(fù)制是否成功。若模型復(fù)制后大鼠逃避潛伏期較模型復(fù)制前顯著延長(P<0.05)，則表明模型復(fù)制成功。

2.2 治療方法 模型復(fù)制成功后，將艾灸組大鼠固定于鼠板上，并固定頭部，根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[8]取“百會”“風(fēng)府”“大椎”，采用清艾條懸于穴位上方約2 cm，每次每穴灸30 min，每日1次，共治療4周。正常組和模型組：與艾灸組平行，只做鼠板上固定，不做其他任何處理。

2.3 行為學(xué)檢測方法 治療結(jié)束后，用Morris水迷宮法對3組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。池壁標(biāo)明的4個等距入水點將水池等分為4個象限，在任一象限中央(與池壁、圓心距離相等)放置目標(biāo)平臺，平臺低于水平面1 cm。保持實驗室溫度在24～25 ℃，水溫在22 ℃左右。

定位航行實驗：治療結(jié)束后第1天練習(xí)站臺，第2～5天將平臺置于第1象限，從池壁4個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池，記錄其在2 min內(nèi)找到并爬上平臺的時間及逃避潛伏期，如大鼠在2 min內(nèi)未發(fā)現(xiàn)平臺，則用工具將其引導(dǎo)至平臺上，停留10 s后，放回籠中，其逃避潛伏期按120 s計算。

空間探索實驗：治療結(jié)束后第6天，在定位航行實驗結(jié)束后撤除平臺，在各個象限相同入水點將大鼠放入池中，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越目標(biāo)象限平臺的次數(shù)。

2.4 免疫組織化學(xué)法測定大鼠皮質(zhì)和海馬RAGE、LRP-1表達(dá)水平 Morris水迷宮測試完畢后，大鼠禁食12 h，每組動物麻醉后經(jīng)左心室行主動脈插管，多聚甲醛固定，斷頭取腦。腦組織制成4～6 μm的石蠟切片備用。切片梯度脫水，PBS洗3次后進(jìn)行微波修復(fù)；冷卻至室溫后，PBS洗3次，血清室溫封閉20 min；加一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加通用型兩步法二抗，室溫孵育30 min；PBS洗3次后DAB顯色，光鏡下觀察顯色情況；蘇木素輕度復(fù)染核3～5 min，自來水浸泡沖洗，鹽酸-乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片任選5個視野，以細(xì)胞胞漿或胞質(zhì)、胞核中出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。分別測定皮質(zhì)和海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞及微血管上RAGE、LRP-1表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較 各時間點模型組逃避潛伏期均較正常組明顯延長(P<0.05)，艾灸組逃避潛伏期均較模型組明顯縮短(P<0.05)。見圖1。模型組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯少于正常組(P<0.05)，艾灸組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯多于模型組(P<0.05)。見圖2。

3.2 3組大鼠海馬和皮質(zhì)組織中RAGE、LRP-1表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)中RAGE表達(dá)增多，LRP-1表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠海馬和皮質(zhì)中RAGE表達(dá)減少，LRP-1表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4、圖5。

3.3 RAGE、LRP-1表達(dá)與穿越平臺次數(shù)相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，大鼠穿越平臺次數(shù)與海馬和皮質(zhì)內(nèi)RAGE存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(海馬：r=-0.81，P<0.05；皮質(zhì)：r=-0.72，P<0.05)。大鼠穿越平臺次數(shù)與海馬和皮質(zhì)內(nèi)LRP-1存在顯著正相關(guān)關(guān)系(海馬：r=0.79，P<0.05；皮質(zhì)：r=0.72，P<0.05)。

4 討論

血管性危險因素是導(dǎo)致VD的主要因素。流行病學(xué)研究表明，高血壓、心臟病、糖尿病和高脂血癥等血管危險因素均可能引發(fā)VD[9]。Hardy J等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腦低血流灌注、血管壁退化、神經(jīng)血管炎癥反應(yīng)等因素可導(dǎo)致腦微環(huán)境異常，血腦屏障功能失調(diào)，從而影響Aβ的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，Aβ不僅存在于AD患者腦內(nèi)，而且與VD也關(guān)系密切。

BMECs是指參與實現(xiàn)血腦屏障選擇性屏障功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與血管神經(jīng)單元的組成[11-12]。多項研究表明，Aβ的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)與BMECs膜上RAGE和LRP-1受體密切相關(guān)，RAGE表達(dá)的增多和LRP-1表達(dá)減少均會導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)的沉積[13-15]。國內(nèi)也有學(xué)者圍繞調(diào)節(jié)RAGE和LRP-1表達(dá)開展治療AD的機(jī)制研究。如周忠光等[16]研究發(fā)現(xiàn)，“益腎調(diào)督”針灸可通過下調(diào)AD小鼠海馬RAGE表達(dá)，減少腦組織中Aβ含量，提高其學(xué)習(xí)記憶能力。胡華等[17]觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參片可促進(jìn)LRP-1的表達(dá)、抑制RAGE表達(dá)，從而對APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用?；赗AGE和LRP-1表達(dá)與BMECs的分泌功能密切相關(guān)，也有學(xué)者開展血管因素引起的認(rèn)知功能障礙研究。喬晉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠RAGE mRNA及其蛋白表達(dá)水平異常增高，提示Aβ代謝異常可能參與高血壓認(rèn)知損害的發(fā)生。么曉軼等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后缺血腦組織糖基化終產(chǎn)物及其受體的表達(dá)升高。綜上所述，RAGE和LRP-1的水平能夠直接影響腦內(nèi)Aβ的含量，從而影響認(rèn)知功能。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

圖3 各組大鼠海馬和皮質(zhì)RAGE、LRP-1表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

注：正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

VD屬于“癡呆”范疇，古代醫(yī)家從經(jīng)絡(luò)腧穴方面對本病積累了豐富全面的認(rèn)識，歷代中醫(yī)文獻(xiàn)中均有“頭為諸陽之會”，督脈“入屬于腦”“入絡(luò)腦”“入腦”等記載，認(rèn)為督脈為陽脈之海，是十二經(jīng)脈之綱領(lǐng)及動力，與腦有著密切聯(lián)系。本研究選取的穴位為百會、大椎、風(fēng)府。百會為督脈經(jīng)穴，是膀胱經(jīng)與督脈的交會穴，膀胱經(jīng)通過此穴“入絡(luò)腦”；大椎穴為“諸陽之會”，具有“通調(diào)頭部氣血”之功；風(fēng)府可“醒腦調(diào)神”，三穴共奏化瘀通絡(luò)、填髓益智之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸督脈組穴治療后大鼠皮質(zhì)和海馬RAGE表達(dá)水平較模型組明顯降低，而LRP-1表達(dá)水平則顯著升高，且大鼠學(xué)習(xí)記憶能力也有所改善，說明艾灸可能通過調(diào)節(jié)RAGE和LRP-1的平衡狀態(tài)起到改善VD認(rèn)知功能的作用。該研究結(jié)果與臨床研究結(jié)果具有一致性，為臨床應(yīng)用艾灸療法參與治療血管性認(rèn)知功能提供了理論依據(jù)。