曹 碩，劉 倩，張 昊，王 朕，沈 紅，張永紅

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室/動物類國家級實驗教學示范中心(北京農(nóng)學院)，北京 102206)

植物精油具有多種生物活性，迷迭香精油是迷迭香次生代謝物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香精油除含有香氣成分,還含有很多藥用成分,如抗菌、抗感染物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、調(diào)節(jié)抗癌物質(zhì)和天然色素等[1]。與迷迭香同科屬的薰衣草，其精油具備較為強烈的芳香氣味，具有鎮(zhèn)靜催眠功能和抗抑郁狂躁特點，還有研究發(fā)現(xiàn)薰衣草具有抗菌、抗氧化、抗凝血性的功能。茶樹是一種同時兼有欣賞價值、香料價值和藥用價值等多種價值屬性的植物，茶樹精油(Tea Tree oil)是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melaleuca)灌木樹種-互葉白千層(Melaleucaalternifolia)的新鮮枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的芳香精油[2]，其具有獨特的香氣。茶樹精油具有很強的抗菌效果，是極具價值和發(fā)展?jié)摿Φ募兲烊恢参锞蚚3]。近年來，對于精油治療功效的體內(nèi)研究大多是用芳香療法，通過嗅覺通路觀察茶樹精油對大腦功能的影響，很少有研究涉及到茶樹精油的抗菌作用。本研究采用藥敏試驗確定茶樹精油的抑菌作用，通過小鼠感染金黃色葡萄球菌建立肺炎模型，模型小鼠經(jīng)鼻吸入茶樹精油，通過分析體重、血常規(guī)、臟器指數(shù)、組織病理變化、肺臟細菌定殖率等指標，探討茶樹精油通過小鼠嗅覺通路對患肺炎的小鼠影響，為其未來開發(fā)應用提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌購于中國獸藥監(jiān)察所，茶樹精油、MHB培養(yǎng)基與瓊脂粉購于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，小鼠白介素6(IL-6)試劑盒購自中國湖北伊萊瑞特生物科技有限公司。Leica EG1150石蠟包埋機、Leica RM2235型切片機(德國Leica公司)，WFZ-UV-2000型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，MEK-7222K五分類血細胞分析儀(日本NIHON KOHDEN公司)。42～56日齡健康昆明小鼠、體重20～22 g，購于中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(SCXK-(京)2016-0002)。

1.2 方 法

1.2.1 菌懸液制備 稱取4.8 g粉末MHB瓊脂培養(yǎng)基加到錐形瓶中并加純水200 mL溶解，密封錐形瓶置于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，備用。取200 μL金黃色葡萄球菌菌液加入已滅菌的MHB錐形瓶中，置于搖床過夜搖10 h，然后取適量過夜菌加到新的培養(yǎng)基中搖6 h，分光光度計檢測其OD值，根據(jù)公式y(tǒng)=1.25x+7.0115(x=OD值)，計算菌落數(shù)為1×10yCFU/mL。

1.2.2 藥敏試驗 按照文獻[4]制備MHB固體培養(yǎng)基，采用涂布法分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌液涂在平皿培養(yǎng)基上，且保證菌液滲透于MHB固體培養(yǎng)基，然后將浸有精油的藥片輕放于涂菌后培養(yǎng)皿相應的區(qū)域。

1.2.3 小鼠分組與其感染金黃色葡萄球菌的模型建立 取小鼠隨機分對照組、模型組、茶樹精油組；將小鼠固定麻醉，然后模型組和茶樹精油組小鼠滴鼻感染金黃色葡萄球菌(2×109CFUs/只)，待小鼠完全吸入菌液后，使其平躺至蘇醒；對照組小鼠滴鼻等量PBS。

1.2.4 茶樹精油處理小鼠 小鼠滴鼻感染細菌2 h后開始吸嗅茶樹精油。

吸嗅方法：首先將盛有2 mL茶樹精油離心管固定于小鼠玻璃罩中上部，打開離心管茶樹精油揮發(fā)彌漫玻璃罩內(nèi)，然后將茶樹精油組小鼠置于罩內(nèi)使小鼠吸嗅茶樹精油30 min，每天2次連續(xù)7 d；同樣方法將模型組和對照組小鼠置于玻璃罩內(nèi)30 min，但不吸嗅任何精油。

1.2.5 小鼠稱重及計算肺臟指數(shù) 所有小鼠感染前(0 d)稱重，然后分別于1、3、5、7 d稱重，同時每組隨機取4只小鼠采血，頸椎脫臼處死，打開腹腔肉眼觀察臟器大小及色澤等，摘取肝、肺、腎、脾臟器稱重及拍照。

1.2.6 小鼠血常規(guī)及細胞因子檢測 試驗結(jié)束后小鼠采血，取部分血液離心制備血清，按照試劑盒說明檢測IL-6；另一部分血液用于血細胞分析儀分析小鼠血常規(guī)指標。

1.2.7 細菌定殖肺臟情況檢測 無菌條件取部分肺臟組織稱重，然后置于滅菌勻漿器內(nèi)，加2 mL無菌PBS快速勻漿、離心，取定量上清勻漿液涂抹于MHB固體培養(yǎng)基上，37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)24 h，最后記錄培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)，按照每毫克肺臟體重，計算肺臟細菌定殖數(shù)。

1.2.8 肺臟組織切片的制作與觀察 取肉眼觀察疑似病變肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精/伊紅染色，顯微鏡觀察、拍照。

1.2.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗分析比較各組數(shù)據(jù)，方差不齊時用t’檢驗，用*和△表示P<0.05即差異顯著，用**和△△表示P<0.01即差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 茶樹精油對常見病原菌的抑菌活性分析

按照文獻[5]抗生素抑菌效果判定標準：抑菌圈直徑>15 mm為最敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，無抑菌圈為不敏感[3]。本試驗采用紙片擴散法檢測迷迭香精油、茶樹精油、薰衣草精油的抑菌活性，薰衣草精油組幾乎未有抑菌圈，茶樹精油組精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈直徑分別為12 mm±2.3 mm和10 mm±1.9 mm，呈現(xiàn)良好的抑菌活性，表明金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對茶樹精油為中度敏感；圖1顯示茶樹精油原液有抑菌圈，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌效果，但茶樹精油經(jīng)5、10和20倍稀釋后沒有抑菌圈(圖2)。

注:M迷迭香精油、C茶樹精油、X薰衣草精油。Note: M rosemary, C tea tree, X lavender.圖1 不同植物精油對金黃色葡萄球菌(A)和大腸桿菌(B)的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effects of different plant essential oils on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

注：1為茶樹精油原液，2、3、4分別為5、10、20倍稀釋的茶樹精油。Note: 1 means tea tree stock solution, 2 means 5-fold dilution, 3 means 10-fold dilution, 4 means 20-fold dilution.圖2 不同稀釋度的茶樹精油對金黃色葡萄球菌(A)和大腸桿菌(B)的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different dilutions of tea tree oil on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

2.2 小鼠體征變化

試驗過程中觀察小鼠體征變化，對照組小鼠無異常體征變化，模型組和茶樹精油組小鼠在感染細菌后開始表現(xiàn)反應強烈，暴躁喜斗，采食減少，大便干結(jié)；但茶樹精油組小鼠吸嗅茶樹精油后表現(xiàn)較為溫和，進食量增加，尿量增多，體征情況逐漸好轉(zhuǎn)并恢復至正常。

2.3 茶樹精油對小鼠體重和肺臟指數(shù)的影響

試驗過程中對不同時間處理的小鼠稱重，結(jié)果隨著飼養(yǎng)時間延長，對照組小鼠平均體重逐漸增加，均高于模型組和茶樹精油組；模型組小鼠體重第1天降低、第3天后體重逐漸升高；茶樹精油組從第1天至第7天小鼠體重逐漸增加且呈上升趨勢，高于模型組但低于對照組(圖3)。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對照組相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖3 茶樹精油對金黃色葡萄球菌感染的小鼠體重影響Fig.3 Effects of tea tree oil on the body weight of the mice with pneumonia infected by Staphylococcus aureus

小鼠肺臟指數(shù)變化結(jié)果見圖4，模型組小鼠肺臟指數(shù)逐漸提高；茶樹精油組小鼠肺臟指數(shù)低于模型組，且小鼠感染細菌第3天至第7天時小鼠肺臟指數(shù)接近對照組(圖4)。

注：與模型組相比，*P<0.05， **P<0.01；與對照組相比，△P<0.05,△△ P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖4 茶樹精油對小鼠肺臟指數(shù)的影響Fig.4 Effects of tea tree oil on lung index of the mice

2.4 茶樹精油對小鼠炎性細胞及炎癥因子的影響

采用血細胞分析儀檢測小鼠感染細菌7 d內(nèi)血液中炎性細胞數(shù)量，對照組小鼠血液中白細胞數(shù)量在1～7 d一直保持相對較低且不變動，模型組小鼠白細胞數(shù)逐漸增加且顯著高于對照組，而茶樹精油組白細胞數(shù)第1天高于對照組并與模型組相近，隨后逐漸降低，第3天接近對照組，第7天升高接近模型組(圖5A)；小鼠血液中中性粒細胞數(shù)總體變化趨勢與白細胞一致，對照組小鼠中性粒細胞數(shù)一直保持相對穩(wěn)定，但顯著低于第1天和第7天模型組，茶樹精油組第3天小鼠中性粒細胞數(shù)明顯降低，且顯著低于模型組(圖5B)。

采用ELISA方法檢測小鼠血清中IL-6含量，結(jié)果對照組小鼠血液IL-6含量從第1天到第7天一直保持相對穩(wěn)定低于模型組和茶樹精油組，而茶樹精油組小鼠第1天血清中IL-6含量略有升高，第3天降低之后一直保持穩(wěn)定水平，且在第3天到第7天低于對照組(圖6)。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對照組相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.圖5 茶樹精油對小鼠血液中炎性細胞的影響(A白細胞，B中性粒細胞)Fig.5 Effect of tea tree oil on inflammatory cells in blood from the mice (A white blood cell, B neutrophil)

圖6 茶樹精油對小鼠血液中IL-6的影響Fig.6 Effect of tea tree oil on IL-6 contents in bloods from the mice

2.5 茶樹精油對金黃色葡萄球菌定殖小鼠肺組織的影響

試驗過程中檢測小鼠肺組織中金黃色葡萄球菌量，模型組小鼠感染細菌后1～3 d內(nèi)每毫克肺組織中金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)較高，第5天和第7天其菌落數(shù)極顯著降低；茶樹精油組小鼠第1天肺組織中菌落數(shù)較高，隨后菌落數(shù)逐漸降低，第3天到第7天顯著減少；對照組小鼠肺組織中細菌數(shù)一直保持相對穩(wěn)定(圖7)。

2.6 茶樹精油對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

試驗結(jié)束打開小鼠腹腔肉眼觀察肺臟變化，與對照組相比，模型組小鼠感染細菌1 d后，肺臟腫脹充血，色澤暗紅，肺葉上均有大小不等和形狀不同的出血斑，肺組織出現(xiàn)腫塊變硬，肺門淋巴結(jié)腫大、出血；茶樹精油組小鼠連續(xù)7 d吸嗅茶樹精油后，肺臟形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)、出血斑減少、充血減弱，第7天的肺臟顏色變淺呈現(xiàn)淡粉色，質(zhì)地變軟(圖8)。

圖7 茶樹精油對金黃色葡萄球菌定殖小鼠肺臟的影響Fig.7 Effects of tea tree oil on Staphylococcus aureus colonizing in the mice lung

肺組織切片HE染色，與對照組比較，模型組小鼠感染細菌后肺組織呈現(xiàn)大量充血，肺泡壁增厚，肺泡組織結(jié)構(gòu)完整性破壞，肺泡腔內(nèi)可見出血；與模型組比較，茶樹精油組小鼠連續(xù)吸嗅茶樹精油后，肺組織充血減輕，肺泡壁較厚，肺泡結(jié)構(gòu)完整性逐步恢復(圖9)。

圖8 小鼠肺臟剖檢肉眼觀察變化Fig.8 Visual observation changes of mouse lung biopsy

圖9 HE染色小鼠第3天肺組織 (100×)Fig.9 HE staining lung tissues from the mice on the third day (100×)

3 討 論

3.1 茶樹精油對金黃色葡萄球菌的體內(nèi)外抗菌效果

研究表明，植物精油具有多種生物活性，且具有抗菌作用。湯奕越[6]利用紙片擴散法檢測肉桂精油、月桂精油及茶樹精油對臨床常見病原菌的抑菌活性，茶樹精油對所試菌株(鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌及糞腸球菌)抑菌作用較弱。胡憶雪[7]等采用茶樹精油對3種痤瘡致病菌(痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)進行定性、定量的抗菌性分析，茶樹精油對3種痤瘡致病菌均具有良好的抑菌作用,其中對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.15 μL/mL。茶樹精油對體外大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌有一定的抑菌作用，其抑菌圈>10 mm；體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)小鼠吸入茶樹精油后肺部細菌定殖數(shù)顯著降低，結(jié)果與報道基本一致。

3.2 茶樹精油對金黃色葡萄球菌感染的小鼠肺組織的影響

Morsoleto等[8]研究表明，茶樹精油可以通過減少炎癥浸潤促進損傷肌肉的恢復。本試驗發(fā)現(xiàn)，感染金黃色葡萄球菌小鼠連續(xù)吸嗅茶樹精油7 d后，小鼠肺組織充血減輕，肺泡間隙炎性細胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)完整性逐步恢復，這可能是茶樹精油抑菌作用的結(jié)果。體重是動物試驗中一個重要的非特異性觀察指標[9]，而以器官重量與體重之比得到的臟器系數(shù)是生物醫(yī)學研究中常用的重要數(shù)據(jù)[10]，臟器系數(shù)高低變化意味著組織器官正常情況[11]。本研究檢測感染金黃色葡萄球菌的小鼠臟器指數(shù)，結(jié)果只感染細菌的模型組小鼠體重明顯減輕，肺臟指數(shù)升高，而感染細菌的小鼠吸嗅茶樹精油后，其肺臟指數(shù)逐漸降低接近對照組，說明茶樹精油呈現(xiàn)的抑菌作用能緩解小鼠肺部炎癥，其作用機理還不清楚有待研究。

3.3 茶樹精油對金黃色葡萄球菌感染小鼠致炎因子及炎性細胞的影響

IL-6是炎癥急性期合成的重要介質(zhì)，作為一種重要的非特異性炎癥因子，促進炎癥反應和組織損傷[12-13]；肺炎時致炎因子能激活中性粒細胞和單核細胞釋放一些炎性細胞因子如IL-6等[14]。IL-6量反映肺炎患者的疾病嚴重程度，Zobel K[15]和Lee YL[16]研究表明，典型的細菌性感染可導致體內(nèi)IL-6含量提高。Groppo等[17]發(fā)現(xiàn)，茶樹精油中的主要成分1,8-桉樹腦和4-萜烯醇能減輕口腔組織炎癥；茶樹精油可溶成分可抑制腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1(IL-1)、IL-10和前列腺素E2等炎癥因子誘導脂多糖的產(chǎn)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染金黃色葡萄球菌后血液中白細胞和中性粒細胞升高、IL-6含量增加，小鼠處于肺炎應激狀態(tài)，但小鼠吸嗅茶樹精油3 d后血液中白細胞數(shù)下降、IL-6含量降低，茶樹精油可能通過降低致炎因子和減少炎性細胞浸潤緩解小鼠肺部炎癥。

綜上所述，茶樹精油對體外大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，小鼠吸嗅茶樹精油對金黃色葡萄球菌感染小鼠致肺炎癥狀有一定的緩解作用，研究提示未來可開發(fā)茶樹精油作為抗炎藥物。