陳 麗，姚允聰

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

蘋果為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉喬木，是世界四大水果之首[1]。蘋果產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，農(nóng)民增收和生態(tài)改良方面具有重要意義。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，目前中國(guó)蘋果栽培面積、總產(chǎn)量和出口量均居世界首位[2-4]。在蘋果產(chǎn)量大幅提升的同時(shí)，蘋果品質(zhì)較低已經(jīng)成為阻礙中國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[5-7]。蘋果品質(zhì)的提升對(duì)于蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展顯得尤為重要。果實(shí)色澤是蘋果果實(shí)重要的外觀品質(zhì)，能夠在一定程度上影響其市場(chǎng)價(jià)格。而紅色果皮主要由花色素苷的含量決定[8]。

花色素苷生物合成的分子機(jī)理研究表明影響花色素苷生物合成的基因有兩類：一類是不同植物共同具有的花色素苷生物合成基因，它們直接編碼花色素苷生物合成酶類[9]；另一類是調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)花色素苷生物合成基因表達(dá)的強(qiáng)度和過(guò)程及色素在空間和時(shí)間上的積累[10]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中一類重要的花色素苷合成調(diào)節(jié)基因，在擬南芥、玉米、蘋果、葡萄等作物的研究表明：MYB 轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)與bHLH類蛋白互作，調(diào)控花色素苷生物合成基因的表達(dá)，從而影響植物器官的色澤發(fā)育[11-12]。在梨中，PbMYB10b的大量表達(dá)能夠促進(jìn)花色素苷生物合成關(guān)鍵基因PbDFR的表達(dá)，從而促進(jìn)梨果皮中花色素苷的積累[13-14]；蘋果果實(shí)中，同源基因MdMYB10、MdMYB10、MdMYB1能夠響應(yīng)低溫、光照的誘導(dǎo)，通過(guò)調(diào)節(jié)DFR、F3’H、ANS、UFGT等花色素苷生物合成途徑下游基因的表達(dá)，在花瓣、葉片、果實(shí)中促進(jìn)花色素苷的積累[15-16]。

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蘋果品種‘紅富士’(Malusdomestica‘Red Fuji’)的不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)花色素苷大量積累的關(guān)鍵時(shí)期，MdMYB1表達(dá)水平顯著上升。表明在蘋果果實(shí)著色過(guò)程中，MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子可能促進(jìn)蘋果果皮花色素苷的積累。本試驗(yàn)通過(guò)在蘋果愈傷組織中過(guò)表達(dá)MdMYB1基因，觀察表型變化并測(cè)定花色素苷類物質(zhì)變化，同步檢測(cè)花色素苷生物合成基因表達(dá)水平的變化，確定MdMYB1對(duì)花色素苷生物合成的調(diào)控功能。

深入研究蘋果中MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子參與的花色素苷調(diào)控機(jī)制，為探索蘋果果皮色澤的形成機(jī)理和生物合成機(jī)理提供良好的理論基礎(chǔ)，并且為蘋果果實(shí)著色的遺傳改良以及經(jīng)濟(jì)效益的提高提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘王林’(Malusdomesticacv. ‘Orin’)愈傷組織，繼代培養(yǎng)愈傷組織生長(zhǎng)在MS+1 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂，pH=5.8的MS培養(yǎng)基上，在25 ℃中黑暗培養(yǎng)。愈傷組織選材由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。培養(yǎng)材料放置于北京農(nóng)學(xué)院組培中心。

1.2 愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化

選擇生長(zhǎng)20 d的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的材料。蘋果愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法參照劉鑫[1]的方法。

1.3 蘋果愈傷組織處理和RT-PCR分析

將未轉(zhuǎn)化愈傷組織和轉(zhuǎn)化MdMYB1愈傷組織分別取1 g樣品，用液氮快速冷凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱保存。采用艾德萊EASYspin多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒，提取液氮凍樣的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit (Perfect Real Time，TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。使用pRI101-MdMYB1的通用引物35S：5′-ACTGACGTAAGGGATGACGCAC-3′和EGFPN：5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.4 MdMYB1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

MdMYB1全長(zhǎng)序列為732 bp，與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pRI101-GFP用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I雙酶切，得到片段連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101備用。

1.5 qRT-PCR分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)參照SYBR?Premix Ex TaqTM II(TliRNaseHPlus)試劑(TAKARA)使用說(shuō)明書，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩步法(95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán))；以蘋果18SRNA作為內(nèi)參基因，上游引物為5′-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3′，下游引物為5′-TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3′；MdMYB1表達(dá)水平檢測(cè)引物：上游引物為5′-GGCGCATGATCTTGGCGACA GT-3′，下游引物為5′-ACGCCACCACAAACGTCG TCG-3′；MdCHS表達(dá)水平檢測(cè)引物：上游引物為5′-GTGACTGTCCAGGAAGTTCGC-3′，下游引物為5′-GCACACACTTGGATTCTCCTTTAG-3′；MdDFR表達(dá)水平檢測(cè)引物：上游引物為5′-CCGAGTCCGAATCCGTTTGT-3′，下游引物為5′-CCTTCTTCTGATTCGTGGGGT-3′；MdANS表達(dá)水平檢測(cè)引物：上游引物為5′-GAGAAGTATGCCAATGACCAGG-3′，下游引物為5′-GGCGGTTGCCTCAATGTAAT-3′。樣品均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，用Excel軟件作圖。

1.6 HPLC法測(cè)定愈傷組織花色素苷含量

用液氮將愈傷組織磨成細(xì)粉，稱取1 g粉末加入1 mL花色素苷提取液(體積比為V甲醇∶V甲酸∶V水=80∶1∶19)，隨后在45 ℃的水浴中超聲50 min。對(duì)花色素苷提取液進(jìn)行純化處理，使用離心機(jī)(12 000 r/min)離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾，裝于液相色譜上樣瓶中用于HPLC檢測(cè)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織轉(zhuǎn)基因鑒定

將含有pRI101-MdMYB1的農(nóng)桿菌與‘王林’愈傷組織共培養(yǎng)，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在抗生素篩選培養(yǎng)基上獲得正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織(圖1A)。使用通用引物檢測(cè)愈傷組織，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因愈傷組織在1 200 bp處有明顯條帶，與pRI101-MdMYB1通用引物之間的大小相符，而未轉(zhuǎn)化愈傷組織無(wú)條帶，表明pRI101-MdMYB1已成功轉(zhuǎn)入愈傷組織中。如圖1所示。

圖1 A. MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織；B. PCR檢測(cè)愈傷組織中對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系中MdMYB1表達(dá)Fig.1 A. MdMYB1 transgenic callus; B. PCR detection of MdMYB1 expression in control and transgenic callus

2.2 低溫和光照處理對(duì)愈傷組織的影響

將未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因愈傷組織放在同一個(gè)培養(yǎng)皿中，在不同的低溫和光照下持續(xù)處理14 d，觀察愈傷組織的表型變化。如表1所示，在高光10 000 lx和低溫16 ℃的條件下，試驗(yàn)組愈傷組織變紅，而對(duì)照組愈傷組織無(wú)明顯變化；說(shuō)明此條件下能促進(jìn)花色素苷的積累，使愈傷組織變紅。

表1 不同低溫和光照組合對(duì)愈傷組織的影響Tab.1 Effects of different low temperatures and lights on callus

2.3 HPLC測(cè)定愈傷組織花色素苷含量變化

為了確定MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織能夠促進(jìn)花色素苷的積累，對(duì)MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行色譜鑒定分析。如圖2所示，MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織中花色素苷含量顯著增加，MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織的花色素苷含量相比WT花色素苷含量明顯升高8倍左右，說(shuō)明MdMYB1可以正調(diào)控蘋果愈傷組織中花色素苷的生物合成，促進(jìn)花色素苷的積累。

圖2 愈傷組織花色素苷含量的變化Fig.2 The change of anthocyanin content in callus

2.4 MdMYB1基因表達(dá)水平

MdMYB1轉(zhuǎn)基因愈傷組織在處理后的表型上發(fā)生變化，顏色變紅(圖3A)。為了確定轉(zhuǎn)化MdMYB1能使愈傷組織變紅，檢測(cè)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后愈傷組織中MdMYB1和花色素苷生物合成基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)MdMYB1對(duì)花色素苷的影響。相比于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因愈傷組織MdMYB1的表達(dá)水平明顯升高20倍左右；并且花色素苷生物合成基因MdCHS，MdDFR，MdANS的表達(dá)水平均顯著上升，證明MdMYB1轉(zhuǎn)錄因子的大量表達(dá)能夠促進(jìn)MdDFR，UFGT，MdANS基因的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的生物合成積累(圖3B)。

注：A.愈傷組織經(jīng)低溫和光照處理后的表型變化；B. qRT-PCR檢測(cè)愈傷組織中MdMYB1基因表達(dá)水平和花色素苷生物合成基因表達(dá)水平。Note: A. The phenotype of callus after low temperature and light treatments; B. Expression level of MdMYB1 and anthocyanin biosynthesis genes in transgenic callus by qRT-PCR.圖3 低溫和光照處理14 d后轉(zhuǎn)MdMYB1愈傷組織表型和表達(dá)分析Fig.3 The phenotype and expression analysis of callus after 14 d low temperature and light treatments

3 討 論

蘋果作為中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)的品質(zhì)影響果實(shí)的經(jīng)濟(jì)效益。而在蘋果的生產(chǎn)過(guò)程中，果實(shí)的色澤影響果實(shí)的品質(zhì)，從而影響消費(fèi)者的選擇。研究蘋果果實(shí)著色對(duì)于改善果實(shí)品質(zhì)以及提高經(jīng)濟(jì)收益具有重要的意義[17]。

花色素苷有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化性能，是蘋果葉、花和果中色澤的重要決定因素。花色素苷本身具有抗氧化活性，在提高觀賞價(jià)值的同時(shí)還能夠增加果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此花色素苷對(duì)于蘋果有至關(guān)重要的作用[18]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在此前的研究中已經(jīng)被證實(shí)其可參與到多種生物和非生物脅迫過(guò)程，通過(guò)調(diào)控類黃酮化合物的生物合成，使植物適應(yīng)不同的環(huán)境變化[19]。

在蘋果上先后發(fā)現(xiàn)MdMYB1、MdMYB10、MdMYBA、MdMYB110a基因能夠響應(yīng)環(huán)境誘導(dǎo)，與MdbHLH蛋白互作，從而調(diào)控蘋果果實(shí)色澤發(fā)育[20-23]。同時(shí)，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色素苷積累主要通過(guò)調(diào)控花色素苷生物合成基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。MdMYB10轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合MdDFR基因的啟動(dòng)子，MdMYB1能夠結(jié)合UFGT基因的啟動(dòng)子，而MdMYBA能夠特定的結(jié)合MdANS基因的啟動(dòng)子，這些轉(zhuǎn)錄因子的大量積累，能夠改變下游花色素苷生物合成基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花色素苷積累，實(shí)現(xiàn)對(duì)果皮色澤的調(diào)控。在本試驗(yàn)中，MdMYB1的大量表達(dá)使花色素苷生物合成基因MdCHS、MdDFR和MdANS表達(dá)水平明顯增加，從而促進(jìn)愈傷組織變紅。與前人研究相符合。本研究為深入了解MdMYB1調(diào)控花色素苷作用機(jī)理提供技術(shù)支撐，為蘋果果實(shí)品質(zhì)的提高提供新方法，新思路。