王 倩 藍蔚青 ，2* 張墨言 孫曉紅 ，2 楊曉慧 謝 晶 ，2

（1上海海洋大學食品學院 上海 201306

2上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心 上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學）上海 201306）

大黃魚（Pseudosciaena crocea）又名石首魚、黃瓜魚、大鮮，為石首魚科黃魚屬暖溫性近海中下層集群洄游魚類，廣泛分布于黃海、東海、臺灣海峽等地，是我國重要的經濟魚類，為傳統(tǒng)“四大海產”之一。大黃魚體內蛋白質、微量元素與維生素含量豐富，具有很好的食療效果，在東南亞有較好的消費市場[1-2]。此外，大黃魚中還含有豐富的微量元素硒，能清除人體代謝產生的自由基，延緩衰老，對各種癌癥的預防有良好效果。水產品由于其水分含量高、營養(yǎng)物質豐富，極易發(fā)生腐敗變質。低溫保鮮是目前應用最為廣泛的水產品保鮮方法。冰藏保鮮是低溫保鮮方法之一，是指在水產品周圍放置冰，以此降低魚體溫度，使其接近冰點而不凍結，從而維持魚體新鮮度的方法[3]。

目前，我國90%以上大黃魚的流通銷售多以冰鮮形式進行[4]，在實現長途運輸時，使原料保持相對較高的新鮮度。冷鏈物流泛指冷藏冷凍類食品在生產、加工、貯藏、運輸和銷售等環(huán)節(jié)始終處于規(guī)定的低溫環(huán)境下，以保障食品質量的特殊供應鏈系統(tǒng)[5]。多數情況下，由于運輸條件與成本的限制，所以水產品在流通期間的溫度達不到規(guī)定要求，樣品易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生溫度波動，從而影響水產品品質。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）技術是目前用于分析微生物群落多樣性與監(jiān)視種群動態(tài)的分子指紋技術手段[6]。相較于傳統(tǒng)微生物學方法，該技術不通過培養(yǎng)，直接從樣品中提取細菌總DNA，能檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，且能同時對多個樣品進行分析，具有快速、高效等優(yōu)點[7-8]。本研究主要模擬大黃魚的冷鏈與斷鏈兩種流通方式，以感官評分、菌落總數與嗜冷菌數、TVB-N值等指標來綜合評價流通期間的溫度變化對大黃魚品質的影響，并通過PCR-DGGE技術分析兩種流通過程中冰藏大黃魚的菌相變化，探究大黃魚流通過程中的腐敗菌，以期為大黃魚的流通運輸與保鮮加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

冰鮮大黃魚2016年1月購自上海蘆潮港海鮮市場，樣品體態(tài)勻稱，鱗片完整且緊貼，魚鰓鮮紅清晰、眼球飽滿，具固有清新氣味，質量（500±50）g，30 min內運至實驗室，層冰層魚裝入泡沫箱內。

1.2 主要藥品試劑

平板計數瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨、氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒。溶菌酶，天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq 酶、100 bp DNA Ladder Marker，大連寶生物工程公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、TEMED，美國Sunshine公司；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 主要儀器設備

FOSS Kjeltec8400凱式定氮儀，丹麥FOSS中國上海有限公司；Testo-176T4型德圖電子溫度記錄儀，德國儀器國際貿易（上海）有限公司；Appendrof PCR儀，德國Eppendorf公司；Dcode system變性凝膠梯度電泳儀、Gel-Doc2000型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5810R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；BCD-256KF冰箱，青島海爾股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；MLS-3750滅菌鍋，日本SANYO公司等。

1.4 原料處理

將大黃魚樣品分成兩組，其中冷鏈組（T1）：從試驗開始至結束，樣品始終處于4℃；斷鏈組（T2）：模擬流通過程，樣品在搬運、運輸、配送和銷售環(huán)節(jié)于 20 ℃分別放置 2，24，8，1 h，其余環(huán)節(jié)溫度均為4℃。模擬冷鏈與斷鏈物流試驗中溫度要求及相關操作標準參照 《食品冷鏈物流技術與管理規(guī)范》[9-10]進行。冷鏈流通過程各環(huán)節(jié)試驗設計如圖1所示，各環(huán)節(jié)完成后兩組樣品均置于4℃條件下貯藏。

圖1 冰鮮大黃魚流通過程模擬示意圖Fig.1 Simulated situations of cold chain logistics process of large yellow croaker with ice

1.5 試驗方法

1.5.1 溫度監(jiān)測 將多點溫度采集儀溫度探頭分別置于魚肉、泡沫箱內冰層與箱蓋間和冷藏箱內，分別監(jiān)測魚體中心、泡沫箱內和泡沫箱外環(huán)境溫度。每隔15 min采集1次數據，對大黃魚流通期間的溫度波動進行實時監(jiān)測。

1.5.2 品質評價

1.5.2.1 感官分析 由6名經專業(yè)訓練的人員組成感官小組對樣品進行感官評價。評價指標參考《SC/T 3101-2010鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃魚》[11]與楊憲時等[12]法，分別在0 h（貯藏初期）、26 h（運輸）、74 h（貯藏中期）、82 h（配送）、106 h（銷售后期）、131 h（貯藏中后期）、203 h、275 h、347 h、395 h（貯藏末期）對魚樣的眼球、魚鰓、質地、氣味等4個方面采用4分法進行感官評分。其中，0分為最佳品質，1分為高品質終點，2分為可接受終點，＞2分視為感官拒絕。

1.5.2.2 TVB-N值 用凱氏定氮儀測定如上時間內樣品的TVB-N值，每個樣品3個平行。

1.5.2.3 菌落總數（TVC）與嗜冷菌數（PBC）分別在如上時間內對兩組樣品取樣進行菌落總數的測定。參考GB/T 4789.2-2010[13]操作。采用平板計數法測定TVC值與PBC值。在（30±1）℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)（48±3）h計數為菌落總數，在（7±1）℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d計數為嗜冷菌數。選取的每個稀釋度做3個平行。

1.5.3 微生物多樣性分析

1.5.3.1 細菌總DNA提取 分別在0 h（貯藏初期）、26 h（運輸）、74 h（貯藏中期）、106 h（銷售后期）、131 h（貯藏中后期）、395 h（貯藏末期）對兩組樣品取樣并進行細菌總DNA提取。參考周琰冰等[14]法，稍作調整，采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA。提取前增加溶菌酶破壁處理，然后進行DNA提取，并于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品在-20℃冰箱貯藏。

1.5.3.2 PCR擴增 以樣品細菌總DNA為模板，進行16S rDNA V3區(qū)段的PCR擴增[15]。參考Muyzer等[16]法，分別選取上游引物為GC 341f（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物選 518 r（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'），擴增片段約 200 bp。PCR反應體系參考Muyzer等[16]法，稍作調整，采用 50.0 μL反應體系，具體為 Premix Taq 25.0 μL、 上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、ddH2O 21.0 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min，35個循環(huán)（95℃變性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸8 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置4℃貯藏備用。

1.5.3.3 DGGE分析 參考Du等[17]法對PCR產物進行DGGE凝膠電泳。用8%聚丙烯酰胺凝膠（質量比為丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=37.5∶1），變性梯度范圍為35%～50%。在1×TAE緩沖溶液中，60℃恒溫條件下，100V電壓電泳10 h。電泳完畢后采用 SYBR greenⅠ（1∶10 000）染色，重復兩次，每次染15 min。清水沖洗后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5.3.4 優(yōu)勢條帶的回收、純化與測序 將染色后的DGGE凝膠置于紫外燈下，用經酒精燈灼燒并冷卻的刀片切下不同位置、分離明顯且亮度較高的條帶。搗碎后分別裝入1.5 mL滅菌離心管中，加入 40 μL無菌水。常溫放置 24 h，取 2 μL回收產物作為模板DNA，用不含GC夾子的341f和518r作為引物進行PCR擴增。PCR反應體系和擴增程序同1.5.3.2節(jié)。PCR擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。出現特異性條帶后用PCR產物純化試劑盒對擴增產物進行純化。將純化后產物送至上海邁浦生物科技有限公司測序，登錄NCBI網站，將測得的序列與數據庫中已知序列進行相似性比對。

1.5.4 數據處理 數據處理：用軟件origin（Pro）8.5繪制曲線，數據間的差異通過統(tǒng)計軟件SPSS13.0中的Duncan新復極差法進行方差分析與多重比較，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 溫度監(jiān)測

溫度是冷鏈物流過程中最主要的影響因素，水產品的冷藏鏈要求是水產品被捕撈后，在其加工、運輸、貯藏到銷售各環(huán)節(jié)都處在低溫環(huán)境下[18]。冰鮮大黃魚流通期間的溫度數據如圖2所示。

圖2 流通過程中溫度實時監(jiān)測圖Fig.2 Real-time temperature monitoring during cold chain logistic process

由圖2可知，冷鏈流通組中，大黃魚魚體中心溫度-1.5～-2.0℃，泡沫箱內溫度3～4℃，泡沫箱外溫度4～5℃，整體波動幅度小。而在斷鏈流通組中，當環(huán)境溫度20℃時，泡沫箱內溫度和魚體中心溫度均有較大波動，魚體中心溫度最高為1.05℃，泡沫箱內溫度達8.69℃。

2.2 感官評價

感官評價是通過人的視覺、味覺、嗅覺、聽覺和觸覺等五官對事物的感覺來鑒別食品質量的評定方法。由于其可直接在實驗室或現場評價，因此能實現產品品質的快速評定，是消費者選購水產品時評判其鮮度的主要方式，現已被世界各國研究人員廣泛采用。感官評定人員對大黃魚的眼球、魚鰓、質地與氣味等方面進行綜合評價，如圖3所示。

大黃魚初始感官分值為0.53±0.15，新鮮度較好，體表呈金黃色，眼球清澈、角膜透明，魚鰓鮮紅、黏液少且透明，肌肉堅實富有彈性。隨著貯藏時間的延長，樣品體表色澤逐漸暗淡，切面光澤度降低，肉質相對松散，固有色澤隨之消失，異味產生。由圖3可見，隨著流通時間的延長，大黃魚的感官分值逐漸上升，品質逐漸劣變。在流通至275 h時，斷鏈組感官分值為2.35±0.13，超出可接受終點，而冷鏈組此時的感官分值為1.85±0.13，第347小時才達到2.27±0.12。可見，溫度波動加速了樣品的腐敗進程。

圖3 冰鮮大黃魚流通過程中感官分值的變化Fig.3 Change of sensory scores in large yellow croaker with ice during logistics process

圖4 冰鮮大黃魚流通過程中TVB-N值的變化Fig.4 Change of TVB-N value in large yellow croaker with ice during logistics process

2.3 TVB-N值

魚肉貯藏過程中，由于微生物及魚體內源酶的共同作用，魚肉蛋白質發(fā)生降解，產生胺類物質，導致TVB-N值升高，因此，TVB-N值是指示水產品腐敗程度的重要指標[19]。根據SC/T 3101-2010[11]可知，TVB-N值≤13 mgN/100 g為一級品，13 mgN/100 g＜TVB-N值≤30 mgN/100 g為合格品，TVB-N值＞30 mgN/100 g為不可接受范圍。

相關研究表明，魚類TVB-N值的變化與樣品種類、生活地域、捕獲季節(jié)、魚齡和性別有關，這也是導致其TVB-N值存在差異的主因[20-21]。冰鮮大黃魚流通過程中TVB-N的變化如圖4所示，大黃魚的初始 TVB-N 值為（12.22±0.78）mgN/100 g，符合一級品的品質要求。隨著流通時間的延長，兩組樣品的微生物活動加劇，使TVB-N值逐漸上升。第275小時，斷鏈組TVB-N值達到（31.04±0.06）mgN/100 g，超出可接受范圍，而冷鏈組TVB-N值僅為（25.68±1.56）mgN/100g。貯藏終點時冷鏈組和斷鏈組的TVB-N值均較高，達（37.27±1.00）mgN/100g與（39.79±0.54）mgN/100g。結合菌落總數的結果可知，冷鏈組貨架期為275～347 h，斷鏈組貨架期為203～275 h。

2.4 菌落總數與嗜冷菌數

菌落總數是水產品最重要的品質評價指標之一，其對水產品在貯藏過程中品質的影響特別明顯，由微生物的生長和新陳代謝所造成的水產品損失可達30%[22-23]。根據大黃魚國標，TVC值＜4 lgCFU/g時為新鮮魚，4 lgCFU/g＜TVC 值＜5 lgCFU/g為二級鮮度，TVC值＞6 lgCFU/g時表明魚體腐敗[24]。

初始菌落數在水產品保藏中不僅是指示其初始新鮮度的重要指標，還是影響鮮魚在冰藏期間腐敗進程的重要因素[25]。如圖5a所示，大黃魚的初始菌落總數為（3.84±0.07）lg（CFU/g），符合一級品的品質要求，與包玉龍等[26]研究得到的冰藏鯽魚初始菌落數3.78 lg（CFU/g）結果一致。大黃魚樣品流通至275 h時，斷鏈組菌落總數達（6.50±0.07）lg（CFU/g），超出可接受范圍。而冷鏈組此時的菌落總數僅為（5.69±0.05）lg（CFU/g）。貯藏末期，冷鏈組的菌落總數為（7.56±0.03）lg（CFU/g），低于斷鏈組的（7.76±0.01）lg（CFU/g）。

大黃魚在斷鏈流通時，其魚體中心溫度和魚體外部環(huán)境溫度有所波動，且嗜冷菌的較適生長溫度范圍為0～20℃，對大黃魚進行嗜冷菌數測定，以此評估兩種流通方式對嗜冷菌正常生長的影響。由圖5b可知，兩組樣品的初始嗜冷菌菌落數為（3.64±0.08）lg（CFU/g）。其中斷鏈組樣品在流通至 131h 時，嗜冷菌數達（5.66±0.09）lg（CFU/g），而冷鏈組嗜冷菌數為（4.90±0.10）lg（CFU/g），斷鏈組嗜冷菌數增長速率大于冷鏈組。在流通末期，冷鏈組和斷鏈組的嗜冷菌數分別為（7.79±0.13）lg（CFU/g）與（7.84±0.10）lg（CFU/g），斷鏈組樣品的嗜冷菌數高于冷鏈組樣品。斷鏈流通時，其溫度環(huán)境為嗜冷菌提供有利的生長條件。與菌落總數相比，兩組樣品的嗜冷菌數大于菌落總數，可能由于流通過程中大黃魚所處溫度環(huán)境更適于嗜冷菌的生長繁殖。

圖5 冰鮮大黃魚流通過程中菌落總數與嗜冷菌數的變化Fig.5 Change of TVC and PBC in large yellow croaker with ice during logistics process

2.5 細菌16S rDNA的V3區(qū)PCR擴增結果

以細菌總DNA為模板，用引物GC341f和518r對細菌的16S rDNA V3區(qū)進行PCR擴增，以不加模板DNA為陰性對照，結果如圖6所示。

由圖6可知，11組樣品均有較亮的特異性擴增條帶，且不加DNA模板的樣品，即陰性對照無條帶，說明引物和ddH2O未被污染。通過與Marker對比發(fā)現，特異性擴增條帶分子質量均在200 bp左右，說明PCR擴增體系與反應程序合適，可用于DGGE分析。

2.6 DGGE圖譜分析

PCR-DGGE可用于評價冰鮮大黃魚在流通期間的微生物生態(tài)多樣性。冰鮮大黃魚流通過程中細菌16S rDNA V3區(qū)PCR產物的DGGE圖譜如圖7所示。同一泳道上不同位置的條帶代表不同的細菌，條帶亮度反映細菌相對量的多少，不同的條帶數體現樣品微生物的豐度[8，27]。

從圖7可看出，冷鏈處理組與斷鏈處理組中每個泳道上均有較多條帶。其中，26 h時，斷鏈組樣品條帶數多于冷鏈組，其它時間點兩組樣品的條帶分布較相似。隨著流通時間的延長，到末期395h時，冷鏈與斷鏈組泳道的條帶數明顯多余其它泳道，且多數條帶較亮，表明貯藏末期，樣品中的微生物種類與數量明顯增加。此時，1～6條帶均變弱，可能是由于低溫貯藏使細菌的生長速度減弱或優(yōu)勢菌群在競爭中占有優(yōu)勢，抑制了其它細菌的生長[6，15]。7、8、10 條帶變亮，9、11 條帶出現。這些條帶亮度深淺與條帶數變化反映冰鮮大黃魚在流通過程中微生物多樣性的演變過程。

圖6 細菌16S rDNA V3區(qū)PCR產物電泳圖Fig.6 Electrophoresis profile of PCR products from bacterial 16S rDNA V3 region

圖7 大黃魚流通過程中的細菌DGGE圖譜Fig.7 DGGE fingerprinting of PCR products of large yellow croaker with ice during logistics process

2.7 主要條帶切膠回收后PCR擴增及測序結果

根據DGGE圖譜，選取條帶1～11進行切膠回收。以回收的DNA為模板進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析得知條帶均在200 bp左右，可知，切膠回收的11個條帶均擴增成功，其中8號、9號條帶較淺，可能由于DGGE膠較薄，切膠過程中造成條帶損失或回收DNA量較少[15]。將PCR產物純化后送檢測序，測序結果與GenBank數據庫中已知序列進行相似性比對，結果如表1所示。

表1 DGGE條帶分離的細菌16S rDNA序列比較Table 1 Comparison of dominant microbe similarity by partial 16S rDNA sequencing fragments from DGGE bands

測序結果中，條帶4濃度不高，PCR產物測序不成功，無法進行比對。由表1可知，冰鮮大黃魚在兩種流通方式下，通過PCR-DGGE法測序比對后得到的微生物主要有不動桿菌、腐生葡萄球菌、假交替單胞菌、副溶血性弧菌、假單胞菌、嗜冷桿菌、熒光假單胞菌與希瓦氏菌。結合圖6的DGGE圖譜和表1測序結果可知，冰鮮大黃魚在流通末期，腐生葡萄球菌、假交替單胞菌和副溶血性弧菌逐漸減少，尤其是副溶血性弧菌在貯藏末期不再出現；假單胞菌、嗜冷桿菌與熒光假單胞菌在流通后期亦有出現，并占有較高比例，希瓦氏菌在流通末期中也有出現。嗜冷桿菌所占比例較高的結論也與前期嗜冷菌數測定結果相吻合，可見低溫流通對其生長有利。同時，不動桿菌與不可培養(yǎng)細菌在樣品流通過程中均存在綜上所述，冰鮮大黃魚在冷鏈和斷鏈兩種流通方式下貯藏末期的主要優(yōu)勢菌是假單胞菌與嗜冷桿菌，同時也有不動桿菌與希瓦氏菌。這與郭全友等[28]研究養(yǎng)殖大黃魚冷藏過程中的優(yōu)勢菌群為腐敗希瓦氏菌和假單胞菌屬結果相似。

假單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，單鞭毛，具運動性，是水產品中一類常見的需氧型腐敗菌[15，29]。許鐘等[30]研究表明，假單胞菌是冷藏養(yǎng)殖羅非魚在0，5℃和10℃貯藏貨架期終點的特定腐敗菌；朱天祥等[31]報道其為冰鮮大黃魚4℃冷藏5 d后的優(yōu)勢腐敗菌。希瓦氏菌為革蘭氏陰性桿菌，郭紅等[32]研究發(fā)現，南美白對蝦達一級鮮度時，在冰溫（-1.4±0.1）℃條件下的特定腐敗菌為希瓦氏菌。不動桿菌存在于魚體表面的黏液、魚鰓及消化道中，也為常見的腐敗細菌[33]。

3 結論

本文研究了冰鮮大黃魚在冷鏈與斷鏈流通中品質及微生物演替規(guī)律。得出結果：隨著流通時間的延長，大黃魚感官分值呈上升趨勢，品質相應劣變，微生物數明顯升高，且斷鏈組增長速率大于冷鏈組。斷鏈組樣品在流通至275 h時，感官分值和菌落總數分別達到（2.35±0.13）lg（CFU/g）和（6.50±0.07）lg（CFU/g），超出可接受范圍。冷鏈組貨架期為275～347 h，而斷鏈組貨架期僅為203～275 h。通過直接提取不同流通階段樣品中的細菌DNA，PCR擴增后進行DGGE電泳分析，并對DGGE圖譜上分離較好且較亮條帶的切膠回收并測序，可獲得冰鮮大黃魚在兩種流通期間微生物的種類變化及優(yōu)勢菌。結果表明：冰鮮大黃魚在流通期間貯藏末期的主要優(yōu)勢菌為假單胞菌與嗜冷桿菌，也有不動桿菌與希瓦氏菌。